Cell Metabolism | 异亮氨酸和缬氨酸介导支链氨基酸的不良代谢效应
近年来，前瞻性和回顾性队列分析表明，摄入膳食蛋白质，特别是动物来源的蛋白质，会增加糖尿病、胰岛素抵抗和癌症的风险，并与更高的总体死亡率相关。人和啮齿动物的支链氨基酸（BCAA；亮氨酸[Leu]，异亮氨酸[Ile]和缬氨酸[Val]）血液水平与胰岛素抵抗，肥胖和糖尿病呈正相关。限制饮食中的BCAAs可以重现低蛋白饮食的许多新陈代谢作用，改善小鼠的终生代谢健康，年轻时开始的限制BCAAs饮食可延长雄性个体寿命；而BCAA补充剂可促进食欲亢进和肥胖症并缩短寿命，因此饮食中BCAA在代谢健康中可能起到关键作用。有证据表明每种BCAA可能对分子过程、代谢和健康产生不同的影响。来自威斯康星大学的Dudley W. Lamming团队利用代谢组学及转录组学技术研究肝脏和血清，揭示每种BCAA在低蛋白饮食的有益作用中都有不同的贡献，支链脂肪酸中的异亮氨酸与缬氨酸可能通过影响代谢来损害人体健康，基于降低异亮氨酸的饮食水平的干预措施或将成为治疗和预防肥胖和糖尿病的新方法，相关研究成果发表于《Cell Metabolism》。
01
降低饮食中的Ile可以涵盖BCAA限制的多种代谢作用
为了探究饮食中BCAA对代谢健康的具体作用，实验设置4组不同的饮食方案，包括Ctrl AA组（包含20种常见AA）、低AA组、低BCAA组和低非BCAA组；所有的饮食都是等热量的，脂肪含量相同，并且通过成比例地调整非必需氨基酸的量来保持氨基酸的卡路里百分含量恒定。结果表明，与Ctrl AA组的小鼠相比，低AA组或低BCAA组的小鼠的葡萄糖耐量显著增加，体重增加减慢；而低非BCAA组的小鼠的葡萄糖耐量无改变，对体重的影响也较小。这些结果证明了BCAA对LP饮食的代谢作用的独特贡献。
为了确定每种BCAA的作用，实验设置4组不同的饮食方案，包括低Leu组、低Ile组、低Val组和低BCAA组。结果表明，与Ctrl AA组的小鼠相比，低Ile组或低BCAA组饮食3周的小鼠的葡萄糖耐量显著增加；低Val组小鼠也表现出葡萄糖耐量改善的趋势，而低Leu组小鼠的葡萄糖耐量无影响。低Ile、低Val或低BCAA饮食的小鼠的丙酮酸耐受性改善，但对胰岛素的反应正常，表明糖异生的抑制作用得到改善；而低Leu组的小鼠与Ctrl AA组的小鼠无差异。且在整个研究中，低Ile组小鼠保持了所有组中最低的体重，而低Val组小鼠的体重也有减轻。降低Ile最显著促进血糖控制和抑制肥胖，而降低Val则没有那么显著的有益效果，而降低Leu并不产生代谢益处，甚至还有一定程度的有害性。通过高胰岛素-正常血糖钳来测量胰岛素敏感性，结果表明低Ile喂养的小鼠的肝胰岛素敏感性显著改善。单独减少饮食中的Ile或Val足以涵盖减少所有三种BCAA的有益生理作用（图1）。
图1. 饮食中限制Ile或Val，而非Leu，可以改善代谢健康
02
低Ile对于低蛋白饮食的有益代谢作用是必要的
接下来，探究低蛋白饮食是否需要降低单个BCAA或所有三种BCAA的饮食水平才能促进代谢健康。通过补充特定氨基酸，实验设置4组不同的补充饮食方案，包括低AA + Leu组、低AA + Ile组、低 AA + Val组和低 AA + BCAA组。结果表明，与Ctrl AA组小鼠相比，低AA组饮食3周的小鼠葡萄糖耐量显著改善；低AA + Ile组或低 AA + BCAA组的葡萄糖耐量逆转；而Leu或Val的补充对葡萄糖耐量未发生逆转。低AA组小鼠的胰岛素敏感性显著改善，补充 Ile，Val或三个BCAA则发生逆转，而补充Leu未发生逆转。补充Ile或补充三种BCAA均会逆转低蛋白饮食对丙酮酸耐受性的影响，而补充Leu或Val则几乎无影响。与Ctrl AA组小鼠相比，低AA组小鼠的进食量增加，体重显著降低，且脂肪和瘦肉量均降低，补充Ile或补充三种BCAA则逆转低AA饮食对体重和瘦肉量的影响，而补充Val对体重或瘦肉量几乎无影响，并且补充Leu甚至促进脂肪和瘦肉的降低。补充BCAA或Ile会逆转低AA饮食促进代谢健康的能力，而补充Val会抑制低AA饮食改善葡萄糖稳态的能力，但不抑制身体组成改变；相反，补充Leu反而增强低AA饮食的效果。总之，降低饮食中的Ile既可以概括低蛋白饮食的有益代谢作用，又是低蛋白饮食最大程度地促进代谢健康的必要条件（图2）。
图2. 补充Ile可显著减弱低蛋白饮食的代谢作用
03
降低饮食中的Ile后的代谢作用不需要肝mTORC1和GCN2
已报道Leu会刺激mTORC1，最近研究表明Ile和Val也是有效的mTORC1激动剂。本研究结果发现，低AA和低Ile饮食并未改变肝脏中mTORC1下游基因S6和mTORC1底物4E-BP1的磷酸化。通过组成型肝mTORC1活性的小鼠模型（该模型中mTORC1的负调节剂Tsc1在肝脏中被特异性敲除（L-TSC1 KO）），给L-TSC1 KO小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠喂食Ctrl AA或低Ile饮食，以确定肝mTORC1是否与低Ile饮食的代谢作用有关。结果发现，低蛋白饮食对L-TSC1 KO小鼠及其野生同窝小鼠的葡萄糖耐量都有改善作用。在两种基因型中，低Ile饮食也可改善肝脏胰岛素敏感性。低蛋白饮食也对WT和L-TSC1 KO小鼠的体重、脂肪量和瘦肉量产生了相似影响。这表明，低蛋白饮食的代谢作用不需要抑制肝mTORC1的活性。
另一个主要的AA敏感激酶是GCN2，它被不带电荷的tRNA激活，对于适应AA缺乏的饮食至关重要。结果发现，与Ctrl AA组小鼠相比，低AA组小鼠中GCN2底物eIF2a的磷酸化增加和下游转录因子ATF4的表达增加，但低Ile组小鼠表达未改变。将肝Gcn2敲除（L-GCN2 KO）及其WT同窝仔的小鼠喂食Ctrl AA或低Ile饮食，且仅在第12天和3周的饮食喂养后进行了GTT（因为GCN2对于最初适应低蛋白饮食至关重要），以检测肝脏GCN2信号是否参与低Ile饮食的代谢作用。结果发现，在两个时间点 低Ile饮食都可以改善WT和L-GCN2 KO小鼠的葡萄糖耐量。低Ile组小鼠，无论其基因型如何，体重、脂肪量和瘦肉量均减少，这表明，低蛋白饮食不通过激活肝GCN2促进代谢健康（图3）。
图3. Ile限制的代谢效应与肝脏mTORC1和GCN2活性无关
04
降低饮食中的Ile导致肝代谢重编程
对喂食Ctrl AA或低Ile饮食3周的小鼠（将其禁食过夜或不禁食后处死）的肝脏进行转录组学和代谢组学分析。转录组学结果表明，降低Ile饮食对肝脏基因表达显著影响，禁食小鼠中184个基因在低Ile饮食和对照饮食中显著改变，而不禁食小鼠中有255个基因在低Ile饮食和对照饮食中显著改变。代谢组学结果表明，在禁食小鼠中，在低Ile饮食和对照饮食中有6种代谢物显著改变；在不禁食小鼠中，在低Ile饮食和对照饮食中有24种代谢物显著改变。通过Metaboanalyst对转录组学和代谢组学数据进行整合，并获得在低Ile组富集的通路，结果发现富集到的通路主要包括碳水化合物的代谢和糖酵解，以及BCAA降解和脂肪酸的生物合成。在禁食的小鼠中，低Ile饮食可以增加糖酵解基因的表达，包括乙酰辅酶A（CoA）以及TCA循环中间体琥珀酸酯和α-酮戊二酸酯。此外，还检测到Leu和Val的水平降低，而其分解代谢中间体羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）和丙酰辅酶A水平增加，这反映了BCAA分解代谢的改变。进一步研究结果也表明，低Ile组小鼠血液中的BCAA水平并未降低，而低Ile小鼠肝脏中Leu和Val水平却趋于升高。在禁食和不禁食状态下，肝脏beta-羟基丁酸（BHB）水平升高，提示生酮增加，可能是由于乙酰乙酸盐和乙酰辅酶A的增加所致；而脂肪酸合酶（Fasn）的表达显著升高，表明脂肪形成增加。这些结果表明，低Ile饮食显著改变肝脏代谢。
为了深入探究低蛋白饮食反应的潜在转录调节因子，使用MAGIC（一种最近开发并经过实验验证的工具）用于转录因子富集分析，结果确定了13个显著富集的转录因子，这些因子被预测为基因表达变化的驱动因素。而且，这些转录因子之一是FOXA2，它被鉴定为肝胰岛素敏感性和生酮的调节剂，且胞质FOXA2是无活性的，而核FOXA2是有活性的。与活性FOXA2的MAGIC预测一致，低Ile喂养的小鼠肝脏中FOXA2的核水平显著增加（图4）。
图4. Ile限制重编程肝脏代谢
05
降低饮食中的Ile会诱导FGF21-UCP1轴并促进能量消耗
如前所示，FoxA2靶基因被低Ile饮食上调最多，而前50个上调基因之一是Fgf21。已报道FGF21是一种能量平衡激素，可促进肝胰岛素敏感性并调节能量稳态，并受到多种压力（包括低蛋白饮食）的诱导调节。尽管低BCAA组小鼠血浆FGF21未增加，但低BCAA饮食会在DIO（高热量饮食喂养构建的小鼠肥胖模型）小鼠中急性诱导FGF21，并且在低BCAA饮食的糖尿病人中也观察到FGF21升高。FGF21促进肝脏生酮作用，结果也表明低Ile组小鼠体内酮（BHB，beta-羟基丁酸）水平升高。同时，低Ile饮食可增加肝脏，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和骨骼肌中Fgf21 mRNA的表达。与该结果一致，低Ile组小鼠血浆中FGF21的水平升高，而低Leu或低Val组中血浆FGF21水平未改变。而且，低Ile和低BCAA组小鼠血浆中，BHB浓度升高，但在低Leu或低Val组小鼠血浆中的BHB浓度不变。
已报道FGF21通过促进WAT的发展推动能量消耗，在低Ile组小鼠和低Val组或低BCAA组小鼠的iWAT中的均观察到米色化现象。相比之下，在低Leu组小鼠的iWAT或任一组的小鼠的性腺WAT中均未观察到米色化现象。低Ile组小鼠显示出与iWAT中的米色化现象一致的转录变化，包括Ucp1（解偶联蛋白1）、 Cidea（细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A）和Elovl3（超长链脂肪酸延长酶3）的表达增加。iWAT的米色化的特征在于诱导了脂肪分解和脂肪生成的无效循环，以及在低Ile组小鼠的iWAT中 几个关键的脂肪生成基因的表达，包括Acc1和Acc2（乙酰辅酶A羧化酶1和2）、Fasn、关键的脂解基因Atgl（脂肪甘油三酸酯脂肪酶）和Lipe（激素敏感性脂肪酶）的增加。
接着作者测量低Ile、低Leu、低Val或低BCAA饮食下小鼠的能量平衡并评估其能量来源的利用。结果表明，在各组之间运动量无差异的情况下，低Ile组或低Val组小鼠的食物消耗增加。在低Ile、低Val或低BCAA饮食喂养的小鼠中，以体重标准化的能量消耗增加。RER（呼吸交换率）反映了底物的利用，在低Val或低BCAA饮食的小鼠中，RER在夜间增加，这表明碳水化合物的利用有所增加。
通过向野生型和Fgf21 敲除小鼠（FGF21 KO）喂入Ctrl AA或低 Ile饮食，并检测其代谢反应来测试FGF21对于低Ile饮食的作用的必要性。结果显示，饮食与基因型之间存在显著的相互作用，在低Ile喂养的野生型小鼠中食物消耗增加，而在低Ile喂养的FGF21 KO小鼠中食物摄入不变。尽管低Ile饮食对食物消耗有基因型依赖性，但是在低Ile饮食下，野生型和FGF21 KO小鼠的体重、脂肪量和瘦肉量相似。使用代谢室，作者分析了两种基因型下低Ile饮食如何改变能量平衡，结果发现，低Ile饮食导致野生型小鼠中能量消耗显著增加，但在FGF21 KO小鼠中这种作用明显减弱，且在光和暗周期中饮食和基因型之间都有显著的相互作用。但是基因型对低Ile饮食改善葡萄糖耐量的能力无影响。这些结果表明，低Ile饮食的部分（而非全部）代谢作用取决于FGF21。还发现，房间温度不会影响对饮食中Ile的整体代谢反应（图5）。
总之，减少饮食中的Ile会重新编程肝脏代谢，并诱导胰岛素敏感性和能量平衡激素FGF21的表达，激活FGF21解偶联蛋白1（UCP1）轴并促进脂肪组织的形成和能量消耗。
图5. 减少膳食Ile诱导FGF21-UCP1轴并促进能量消耗
06
在不健康的西方饮食下，低Ile的代谢益处得到放大
对小鼠进行西方饮食（WD）饮食预适应12周，通过降低每种BCAA的水平（单独每种BCAA或三个BCAA的水平都降低67％；所有的WD都是等热量的，脂肪含量相同），检测其对小鼠体内代谢的影响，结果显示，在WD饮食下，低 Ile、低 Val或低 BCAA组小鼠比Ctrl AA组小鼠进食量增加，但体重和脂肪快速降低，瘦肉量不变，总体效果是改善了肥胖。与非WD Ctrl AA组小鼠相比，WD低Ile饮食的小鼠体重和脂肪减少最明显，且瘦肉量和脂肪量均减少。在WD饮食下，低Leu组小鼠的体重和身体组成与Ctrl AA组小鼠无差异。相对于非WD Ctrl AA组小鼠， WD 低 Ile，WD 低 Val或WD 低 BCAA饮食的小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性显著改善，而WD Ctrl AA组和WD 低 Leu组小鼠葡萄糖和胰岛素抵抗无改善。这些结果表明，减少饮食中的Ile，Val或三种BCAA可以恢复WD饮食的DIO小鼠的代谢健康，而限制Leu则没有此作用。
采用高胰岛素正常血糖钳来测量WD Ctrl AA和WD低 Ile喂养的小鼠的胰岛素敏感性。结果发现，WD低Ile组小鼠所需的GIR显著高于WD Ctrl AA喂养的小鼠。低Ile组小鼠对几种关键代谢组织（包括棕色脂肪组织（BAT），心脏，iWAT和骨骼肌）的葡萄糖摄取率显著增加。根据循环中标记葡萄糖的比例计算出人体的葡萄糖摄取量和肝葡萄糖生成量，结果表明WD低Ile饮食小鼠的肝胰岛素敏感性显著改善。且WD 低 Ile，WD 低 Val和WD 低 BCAA饮食对身体组成和血糖控制的积极作用伴随着能量消耗的增加。已报道WD饮食会引起肝脏脂肪变性，检测WD饮食下小鼠肝脏中脂质的蓄积情况，结果显示WD Ctrl AA和WD 低 Leu饮食的小鼠肝脏中脂质明显积累，而WD 低 Ile，WD 低 Val或WD 低 BCAA饮食的小鼠肝脂质沉积减少，脂滴减少，与非WD Ctrl AA组小鼠中水平相同。这些结果表明，即使继续采用消耗高脂肪，高蔗糖的WD饮食，减少饮食中的BCAA足以恢复DIO小鼠的代谢健康（图6）。
图6. 限制饮食Ile或Val可改善高脂诱导肥胖DIO小鼠的代谢健康
07
补充Ile削弱了低蛋白对肥胖的有益作用
在WD饮食下，补充BCAA探究其影响，实验设置WD Ctrl AA、WD低AA、WD 低 AA + Leu、WD低AA + Ile、WD低AA + Val和WD 低 AA + BCAA组共6个组别，结果表明，WD 低 AA组小鼠的食物消耗量显著升高，而添加三种BCAA中的任一种则抑制其升高，在WD 低 AA + BCAA饮食的小鼠中达到统计学显著性。与WD Ctrl AA组小鼠相比，WD低AA组小鼠的体重，脂肪量和瘦肉量减少，补充Ile或BCAA则逆转对其体重和脂肪量和瘦肉量的影响。而补充Val对体重和身体组成的影响最小，补充Leu甚至增强了WD低AA饮食对瘦肉量的影响。
WD低AA饮食可以改善葡萄糖耐量，补充Ile或所有BCAA削弱了这种影响，而补充Leu或Val则无削弱作用。WD低AA饮食可改善胰岛素敏感性，补充Ile或Leu削弱了这种影响。这些结果表明，降低Ile饮食对低蛋白饮食的全部代谢益处是必需的，而补充膳食Ile（而非Val或Leu）足以使WD 低 AA小鼠在代谢上与WD Ctrl AA小鼠相似。
08
人体中Ile摄入量增加与BMI升高有关
最后，在临床样本中，探究饮食中的Ile水平是否与人类代谢健康的改变有关。在一个随机选择的基于人群的成年人横断面（> 18岁）样本研究中，研究Ile摄入量（相对于总蛋白质）与BMI（身体质量指数）之间的关联。在对混杂因素进行调整后，作者发现相对于总蛋白质，饮食中Ile摄入量的增加（例如蛋白质的4％至5％）与BMI的增加有关（p ＝ 0.046）（图7）。这些结果与动物研究结果一致，表明在以人群为基础的临床样本中，膳食摄入的蛋白质具有较高的Ile比例会增加BMI指数，而Leu和Val的摄入与BMI无关。这些结果表明，膳食蛋白质的质量，尤其是膳食蛋白质中Ile的比例，也可能成为人类代谢健康的重要调节剂，基于降低Ile的饮食水平的干预措施可能是治疗和预防肥胖和糖尿病的新方法。
图7. Ile摄入量的增加削弱了LP对肥胖的有益作用并与人体较高的BMI有关
小结
低蛋白饮食可促进啮齿动物和人类的代谢健康，低蛋白饮食的益处可通过特别降低三种支链氨基酸（BCAA），亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸的饮食水平来概括。本研究证明，每种BCAA都有独特的代谢作用。低异亮氨酸饮食可重编程肝和脂肪代谢，增加肝胰岛素敏感性和生酮作用，并增加能量消耗，从而激活FGF21-UCP1轴。限制缬氨酸可诱导相似但更适度的代谢作用，而亮氨酸含量低则不存在这些作用。减少异亮氨酸或缬氨酸可迅速恢复高脂饮食诱导的肥胖小鼠的代谢健康。最后，该研究证明了饮食中异亮氨酸水平的变化有助于解释人体的体重指数差异。该研究结果揭示了异亮氨酸作为对膳食BCAAs的不良代谢反应和代谢健康的关键调节因子，并建议减少膳食异亮氨酸作为治疗和预防肥胖和糖尿病的新途径。
绘谱帮你测
从多年前的明星营养补充剂到近年来的代谢危险因子，支链氨基酸一直是营养学、代谢内分泌、肿瘤学等学科关注的热点，支链氨基酸处于代谢中枢，与数个代谢通路相关，针对支链氨基酸的干预必将对多种疾病产生影响。本文中的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等多种氨基酸及其相关代谢物检测，麦特绘谱均可提供全套解决方案！欢迎联系助理取得详细资料。
参考文献
Deyang Yu, et al. The adverse metabolic effects of branched-chain amino acids are mediated by isoleucine and valine. Cell Metabolism. 2021. https://doi.org/ 10.1016/j.cmet.2021.03.025.