磷酸化蛋白检测 5 种方法大 PK，究竟谁是第一名？

追溯蛋白磷酸化的发现历程，必须提到的是 1930 年科里夫妇在糖代谢的研究中首次发现两种不同形式的磷酸化蛋白。

然而，这个发现沉寂多年，直到 1954 年，好基友 Fischer 和 Krebs 再次开展深入研究，才发现蛋白的磷酸化和去磷酸化，并凭此获得 1992 年的诺贝尔奖。

磷酸化蛋白对细胞通路的重要性毋庸赘述，这种关键的翻译后修饰参与广泛的细胞活动调节，包括细胞周期、细胞分化、代谢和神经元通讯等。蛋白磷酸化的异常也与众多疾病相关，是疾病机理研究的重要研究方向。

而在检测蛋白磷酸化时，有众多方法可供选择，本文就来帮大家盘一盘各种方法的特色。

激酶活性测定

蛋白激酶将磷酸基团从 ATP 转移到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，即发生蛋白的磷酸化，直接影响靶标的活性和功能。因此，评估单个特异性激酶的活性可为通路解析提供有价值的信息。

要测量生物样品中的激酶活性，常规方法是添加 ATP，并将免疫沉淀的激酶与外源底物在体外共同孵育，最后通过比色、放射标记、荧光检测等报告系统测量磷酸化底物。R&D Systems^® 能提供非放射性通用激酶活性试剂盒，用于定量分析任何可产生 ADP 的激酶活性（货号 EA004）。

通用激酶活性试剂盒检测原理

上述方法可以了解特定激酶的作用，但对磷酸化蛋白的揭示较少，且体外活性测定无法准确解析潜在的内源性磷酸酶。为直接研究蛋白的磷酸化，磷酸化抗体应运而生，并因此衍生出多种免疫学测定方法。

Western Blot

Western Blot 是评估蛋白磷酸化状态的常用方法，且大部分实验室具备开展该实验的条件。用 SDS-PAGE 分离生物样品，随后转移到膜（PVDF 或硝酸纤维素膜），采用磷酸化抗体鉴定目的蛋白的磷酸化水平。

由于磷酸化蛋白的检测结果可能随样本处理或操作误差而变化，研究人员通常用同一种蛋白的总表达水平作为参考，通过确定磷酸化蛋白和总蛋白的相对比值来反映磷酸化情况，判断信号通路是否被激活。

CEM 细胞中磷酸化/去磷酸化 p53 的检测，分别用磷酸化 p53 多克隆抗体（R&D Systems^®，货号 AF1043）和 p53 多克隆抗体（R&D Systems^®，货号 AF1355）进行检测。

夹心法 ELISA

与 WB 相比，典型的夹心法 ELISA 检测蛋白磷酸化具有如下优势：

• 含有标准品，实现定量；

• 捕获抗体和检测抗体以夹心的方式检测磷酸化蛋白，特异性更高；

• 具有更高的灵敏度，便于检测少量样本或低丰度蛋白；

• 微孔板的形式比传统的 WB 具有更高的通量。

采用 DuoSet^® IC 试剂盒（R&D Systems^®，货号 DYC1095B-2）检测给药后 pEGFR 的比例。图片来源：doi: 10.1158/1535-7163.MCT-17-0758.

胞内流式细胞术及 ICC/IHC

上述体外的免疫学检测可用于验证猜想及药物筛选，如果需要准确揭示特定信号转导网络，则需要分析完整细胞内的蛋白磷酸化情况，可以采用胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC / IHC）。

流式细胞术可以实现快速、定量的单细胞分析。对于异质群体而言，通过细胞表面标志物表型分析可以检测特定细胞类型中的目的蛋白，而无需预先分离细胞。该方法适合于分析小的、稀少的细胞群，不必担心在细胞分选过程中发生细胞的损失或蛋白表达的改变。

胞内流式检测 IL-4（R&D Systems^®，货号 204-IL）未激活（A）或激活（B）的 STAT6 磷酸化，分别用别藻蓝素偶联的 STAT6 抗体（R&D Systems^®，货号 IC2167A）和藻红蛋白偶联的磷酸化 STAT6 抗体（R&D Systems^®，货号 IC 3717P）进行检测。

与其它检测磷酸化的方法相比，ICC/IHC 通常是用于确定细胞内/组织切片中的蛋白定位。通过流式细胞术和 ICC 检测磷酸化蛋白，需要刺激细胞并用甲醛/多聚甲醛固定，然后用透化剂处理，让磷酸化抗体进入细胞。

采用温和的透化剂可以检测细胞质蛋白，而核蛋白的检测可能需要酒精。酒精透化也可增强磷酸化特异抗体的磷酸化蛋白检测，因酒精具有变性的特点。

ICC 检测检测 IL-4 激活（A）或未激活（B）的 STAT6 磷酸化，分别用磷酸化 STAT6 抗体（R&D Systems^®，货号 AF3717）及 NorthernLights™ 557 偶联的二抗检测（R&D Systems^®，货号 NL004），DAPI 染色细胞核。IHC 检测大鼠大脑皮层的磷酸化 ERK1/ERK2（C，R&D Systems^®，货号 AF1018）。

固相抗体芯片

如果想知道某个样本中多种蛋白磷酸化的状态，但是同时检测多个蛋白的样本量不足，无法进行多重 WB 或者多重 ELISA，如何解决这种困境？Proteome Profiler™ 固相抗体芯片可以在同一样本中同时检测多种蛋白。与 WB 类似的是，固相抗体芯片也可以根据灰度值对蛋白进行半定量。

MEK1/2 抑制剂 U0126 对 ERK 通路的影响，采用固相抗体芯片（R&D Systems^®，货号 ARY002B）检测 HeLa 细胞中 U0126（Tocris^®，货号 1144）处理前后通路中各磷酸化蛋白的表达。

评估蛋白磷酸化是揭秘细胞活动的重要内容，不同的实验方法各有千秋，应根据实验设计及实际情况选择合适的检测手段（Table 1）。必要时，不应该走单行线，而应该选择「组合拳」。