物质的气、液、固态三相变化是生活中常见的现象。生命体，作为物质的一种，也不例外。2009年，科学家首次报道了细胞内生物大分子存在“液-液相分离”现象。实际上，相变在细胞中普遍存在，而相变失调可能是一些疾病的病理病因——这为科学家们审视相关疾病提供了新的视角。
撰文 | 蒋昕
人们有时候会用“单细胞生物”戏称一个人头脑简单甚至缺心眼儿，其实，细胞一点也不简单。一个细胞就像是一座由蛋白质、DNA、RNA等“砖块”建造的城邦，这些“砖块”搭建了不同的办公机构，保障城邦的正常运转。而散布在胞内的细胞器（organelle）就是这些重要的办公场所。
其中，有一类细胞器被称为有膜细胞器，它们在磷脂膜建造的“办公室”里干活儿，例如产生能量的线粒体、贮藏和转录DNA并产生RNA的细胞核、翻译和加工蛋白质的内质网等。
此外，要正常发挥细胞功能，许多没有“办公室”的无膜细胞器也必不可少，包括细胞核内存储核糖体RNA（rRNA）的核仁，细胞质内对各种刺激起反应的应激颗粒（stress granule）以及构成有丝分裂纺锤体的中心体等。这些细胞器没有磷脂膜包裹，可以更动态地形成或消失。
就像室外跳广场舞的大妈群体一样，无膜细胞器有相对固定的队员，大家在某个时间聚集在一起，完成活动后又自行解散。可是，蛋白质、DNA这样的小零件是如何做到和大妈一样聪明，自己组建“办公区域”呢？从这个问题出发，本文将通过介绍人们对无膜细胞器形成原理的探索，引出“液-液相分离”这种组建“办公区域”的方法，以及这种新的“建筑模式”如何帮助我们了解细胞器功能和治疗人类疾病。
相比于由磷脂膜分隔的细胞器，无膜细胞器的形成及物理性质更为扑朔迷离。我们以P颗粒为例来探究这个谜题。P颗粒（P granule）是一种由蛋白质和RNA组成的无膜细胞器，直径约为0.1-5 μm，它们位于秀丽隐杆线虫生殖细胞的细胞质中。P颗粒的神奇之处在于，当线虫的胚胎处于单细胞状态时，它们均匀地分布在整个细胞质中，但随着单细胞要开始分裂，P颗粒会慢慢朝细胞后侧集中。有P颗粒分布的后侧在分裂后将成为生殖前体细胞，而没有P颗粒的一侧则成为体细胞前体细胞（视频1）。视频1. 用绿色荧光蛋白标记的P颗粒在线虫胚胎细胞分裂过程中逐渐向细胞后侧（视频右边）移动[1]那么，没有“外墙”的P颗粒是如何整齐地出现在细胞后侧的呢？直到P颗粒发现26年后的2009年，德国马克斯普朗克研究所的Clifford Brangwynne博士和他的导师Anthony Hyman博士偶然以一次暑期课程教学为契机，终于为这个问题交上了一份漂亮的答卷[1]。在生活中，延时摄影常用于观察长时程的动态变化，这几位科学家也采用了这一策略来观测P颗粒的运动。他们把便于观察的荧光蛋白连接到P颗粒里的代表蛋白质上，通过延时拍摄荧光蛋白的位置来掌握P颗粒的动态。有趣的是，观测结果显示，P颗粒并不是一粒粒地慢慢朝细胞后侧移动，而是先逐渐“蒸发”不见，然后再慢慢于细胞后侧重新凝聚。这说明在胚胎细胞分裂的过程中，P颗粒经历了先解散后凝聚的过程（视频1）。为什么P颗粒最后都乖乖地只在细胞后侧重聚呢？Brangwynne博士等人又发现，P颗粒在细胞分裂时“跑偏”的方向正好与另一种“跑偏”的蛋白质MEX-5相反。而如果让MEX-5在细胞里均匀分布，P颗粒也就相对应地、均匀地待在细胞里了。我们可以用水的液化来类比这个肉眼看不见的细胞内事件。假设有个箱子，内部温度从左到右逐渐增高，我们在其中放入一个装满水蒸气的瓶子，于是瓶子左边温度低而右边温度高。几分钟后我们将会发现在瓶子左侧，水蒸气遇冷液化成了小水珠（图1）。而在线虫胚胎细胞中，如果把解散的P颗粒类比为水蒸气，MEX-5蛋白的不均匀分布就是造成水蒸气只在单侧凝结的温度梯度。
图1. 一个装满水蒸气的瓶子放置于有着梯度温度的盒子里，低温侧的水蒸气液化成水滴。（来源：作者手绘）
更有意思的是， Brangwynne博士和同事们还利用一系列精巧的实验证明了P颗粒在细胞质中确实有如水一般的液态特征：它们大多呈圆球形，具有表面张力并且在受压的情况下会在细胞内流动、交融（视频2）。
视频2. 如果用两块玻璃片挤压摩擦线虫卵细胞，就会观察到受到剪应力（shear stress）的P颗粒在细胞质内像液滴般游动，较小的P颗粒还会汇聚成“大水滴”[1]
这篇2009年的论文不仅精妙地回答了胚胎细胞分裂时P颗粒的不对称分布之谜，更揭示了无膜细胞器在细胞质中会以液态存在的现象。这个结论就像是一颗石子投入平静的水面，激起了层层涟漪：后续的许多研究发现，除了P颗粒以外，中心体、应激颗粒、核仁等无膜细胞器也以液滴的形式存在。当然，人们还想知道，这种液滴形态是如何产生的？这种液体特性会对无膜细胞器发挥功能带来什么影响？
无膜细胞器利用“液-液相分离”召集“工作人员”，搭建“办公区”
不知大家注意到没有，液体形式存在的无膜细胞器其实也身处于同是液态的细胞浆（cytosol）或核液（nucleus sap）中，且互相有着清晰的界限。这种液体和液体之间互不相溶的现象并不稀罕，比如喝汤时浮在表面的香油，分层的高颜值鸡尾酒等。在教科书上，这种现象被称为 “液-液相分离”（liquid-liquid phase separation）。正是这种现象，完美地让无膜细胞器有了相对独立的办公场所，能更高效地完成任务。但无膜细胞器本身又是如何成为液态的呢？无膜细胞器中有大量蛋白质、DNA和RNA，如果单独把这些物质拎出来，并发现它们也都能在溶液中液-液相分离，也许就能还原这些成分在细胞里凝聚成液滴的过程了。其实研究蛋白质结构的科学家早就知道，某些提纯的蛋白质能在高浓度的情况下于溶液里产生液-液相分离，所以从方法上要回答这个问题不算复杂。很快，研究者们报告了一系列现象：一些无膜细胞器中的组成蛋白以及有着简单重复序列的RNA和DNA能在细胞外形成如油滴般形态（图2）。
图2. P颗粒中的LAF1蛋白，核仁中的GAR-1ΔN蛋白，应激颗粒中的FUS蛋白都能在细胞外呈现液-液相分离[2-4]
那么，这些无膜细胞器的组成成分为什么会“液化”呢？这是个很有实用价值的问题，因为我们一旦掌握了其中的规律，就有希望调控无膜细胞器的形成。以蛋白质为例，相比于平时如“气体“般的弥散分布，蛋白质化为液态后，相互接触得更多。所以，反过来说，如果能让蛋白质连接得更紧密，就自然能促进其形成液体。有三种情况能促使蛋白质化为液体。首先，蛋白质的量越多，越容易形成液体；其次，蛋白质本身越黏就越容易粘上更多的同伴；最后，如果蛋白本身具有疏水的特性，那就天然地不容易和水互溶了。第一和第三个特质都比较容易控制或预测，第二个特质就比较有趣了……究竟什么样的蛋白是“黏哒哒”的呢？这个问题的答案仍在不停地完善中。原因可能有许多，其中最主要的是，这些蛋白上要有方便与别的蛋白“牵手”的黏性位点。举个例子，如果组成蛋白质的氨基酸序列太单一，那这个蛋白质就很难被包装成固定的三维结构，这样的“百变蛋白”会像粘合剂一样吸引其他蛋白或核酸（图3）。不仅如此，有简单重复序列结构的RNA也会自带黏性，出现液-液相分离（图4）。
图3 . 有简单氨基酸序列存在的蛋白不容易被包装成固定的结构，如该蛋白两端的结构域，像两支灵活的手“呼朋引伴” | 来源：维基百科
图4. 由CUG或CAG核苷酸序列重复排列47次构成的RNA能形成液滴[5]除了在无膜细胞器中，液-液相分离的形式还在基因转录机器，mRNA剪切体甚至一些细胞组成——比如神经细胞传递信号的突触区域——发挥功能。液-液相分离除了能为细胞器分隔出独立的工作区间外，这个工作间内高度密集的“员工”也能大大提高工作效率。此外，每个分离出的小液滴也是个微型仓库，那些暂时用不着的“货物”可以被黏黏的蛋白拉来临时储存在里面，方便调节细胞整体的工作节奏。但若不小心拉来了别人家的关键分子，液-液相分离也会减缓一些反应的进行。
像雾像雨又像……冰雹子，相变带来的风险和机遇
既然蛋白质这些组成细胞的“砖头”能凝结成雨一般的液珠，那是否还能凝固成“冰雹子”呢？如果你听说过“蛋白质晶体结构解析”，应该不难回答这个问题。比如图2中提到的FUS蛋白就能慢慢从液体变成果冻一样的胶状，最后成为尖牙利爪的结晶体（图5）。这种在不同物理形态中变化的过程就是相变（phase transition）。图5. 纯化的FUS蛋白随着浓度的升高能从液体状（左1）成为凝胶状（左2），而随着时间的增加胶状甚至会进一步固化成晶体状（右）[6]固/液形态对无膜细胞器的功能有什么影响呢？对此，Hyman博士有一个很好玩的比喻：固态情形下的大分子就像在教室里上课的学生，在任何时间每个同学的位子都不会改变；但如果这群学生在操场上体育课，固态就变为了液态，每个时间点谁在哪里出现都变成未知了。简单来说，固体与液体相比少了动态，而动态是细胞生命所必须的。而如何检测一个无膜细胞器内的分子动态水平呢？以核仁为例，如果我们将核仁里的代表蛋白质连接上红色荧光蛋白，再用一束高强度的激光照射这滴红色小球上的一点，由于光漂白作用，被照射的那一点红色就会瞬间消失（如图6中间图）。但由于核仁内部有无数跑来跑去带着红色荧光的蛋白，所以没有被光漂白的荧光蛋白就会移动着填补上这个空缺（图6）。而通过计算填补所需的时间以及对比填补前后被漂白处的荧光亮度，我们就能知道这滴核仁内部的分子动态水平。
图6 .由红色荧光蛋白标记的核仁组成蛋白光漂白恢复的过程[7]
随着研究的深入，科学家们惊奇地发现，很多和疾病、特别是脑疾病相关的蛋白或RNA会发生相变。以FUS蛋白为例：FUS蛋白不仅本身能液-液相分离，还能参与应激颗粒的液-液相分离，而Fus基因的突变能造成脑脊髓侧索硬化症（ALS），也就是我们熟知的渐冻症。并且，随着渐冻症病情的发展，部分原本应是液态的应激颗粒竟有渐渐朝固态转变的现象，而这种“变性”了的应激颗粒非常不利于细胞的存活。研究也发现，Fus基因的突变能够加速这一变性的过程。那是否能将这种“变性”的应激颗粒重新“融化”成液态，从而治疗渐冻症呢？Hyman博士实验室最近发表的一篇论文就朝着这个方向做出了大胆的尝试[8]。他们筛选出了能重新提高应激颗粒中FUS蛋白动态的小分子。他们将这种小分子试用于线虫、果蝇和人类细胞的ALS模型中后，都观察到了显著的症状改善。我们相信这个振奋人心的结果会进一步带动更多研发工作，把相变换/相分离过程作为疾病治疗的靶标。除了这篇文章使用到的小分子药物筛选法，如果科学家们能更深入了解液-液相分离的形成以及液-固相变发生的机制，比如找到其过程中的关键和限速步骤等，也将会推动我们研究疾病机制和治疗方法。除此以外，相变或相分离又是如何影响细胞器或蛋白质发挥功能的？这些问题也是2009年那颗石子投下后激起的涟漪，等待着我们解答。1.Brangwynne, C.P., et al., Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation. Science, 2009. 324(5935): p. 1729-32.2.Elbaum-Garfinkle, S., et al., The disordered P granule protein LAF-1 drives phase separation into droplets with tunable viscosity and dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015. 112(23): p. 7189-94.3.Taylor, N., et al., Biophysical characterization of organelle-based RNA/protein liquid phases using microfluidics. Soft Matter, 2016. 12(45): p. 9142-9150.4.Monahan, Z., et al., Phosphorylation of the FUS low-complexity domain disrupts phase separation, aggregation, and toxicity. EMBO J, 2017. 36(20): p. 2951-2967.5.Jain, A. and R.D. Vale, RNA phase transitions in repeat expansion disorders. Nature, 2017. 546(7657): p. 243-247.6.Patel, A., et al., A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell, 2015. 162(5): p. 1066-77.7.Feric, M., et al., Coexisting Liquid Phases Underlie Nucleolar Subcompartments. Cell, 2016. 165(7): p. 1686-1697.8. Wheeler, R.J., et al, Small molecules for modulating protein driven liquid-liquid phase separation in treating neurodegenerative disease. BioRxiv, 2019, doi: https://doi.org/10.1101/721001.
