开展实验之前，要做哪些准备？

经常有客户来咨询，

为什么我的WB实验中没有得到目的蛋白条带？

当你面对白板，除了看宝典：妈呀，又白板！ ——有问题，别喊妈，先自查，还该如何应对？？？

通过长期和客户探讨实验问题，我们发现出现白板的原因真的很多：蛋白提取的不好；样品保存不当；处理条件不对；甚至有些WB操作问题等等……只要客户耐心去寻找根源，一步步发现并解决它，我们终会发现，很多结果证明并非抗体*的问题。

*声明：此处仅代表CST抗体，并非市面所有。

一些小的改变可能会导致结果的巨大变化。做WB和IP的时候，一些抗体对实验条件尤其敏感。我们建议客户首先要确定以下几个基本问题：

1》目的细胞是否表达这种蛋白？丰度如何？

2》提取蛋白的细胞裂解液是否加入了蛋白酶抑制剂？对于磷酸化蛋白是否还加入了磷酸酶抑制剂？防止蛋白降解。

3》是否按照CST建议的操作方法进行实验?

4》刺激处理是否恰当？

抗体是否有问题？我们提供专门的细胞裂解物来检测抗体是否存在问题，这是最好和最快捷的方法。

下面让我们具体地看一下这几个方面：

1》目的细胞是否表达这种蛋白？丰度如何？

首先要了解你的目的蛋白和实验样本，首先我们建议去查阅一些参考文献，看看已发表的文章里用同样的细胞系，这个蛋白的表达含量如何, 如果没有时间去查阅相关的文献，我们推荐BioGPS这个网站：http://biogps.org。

以IRS-1为例，首先在空白方框里输入你要查找的蛋白的英文名称：

纯友好推荐，非广告

点击search，进入到下面的页面后，可以对照细胞系看下含量如何，没有到Median这个临界点的话说明该蛋白在这个细胞系里含量不是很高。需要注意的是，这个数据来源整合了GeneAtlas基因表达芯片的结果。其显示的是mRNA的含量，与蛋白水平的表达可能存在一定出入，请大家留意。

2》提取蛋白的细胞裂解液是否加入了蛋白酶抑制剂？

对于磷酸化蛋白是否还加入了磷酸酶抑制剂？裂解细胞时，加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶去分解其他有用的蛋白质（防止蛋白降解），向细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂后可以保护细胞提取物中的靶蛋白；当研究特异靶蛋白的磷酸化状态时，磷酸化的残基必须保持完整。当细胞被裂解提取全细胞提取物时，会发生正常的细胞信号调节缺失，并且细胞提取物中的磷酸酶可以在失控的情况下使蛋白发生去磷酸化。向细胞裂解液中加入磷酸酶抑制剂后可以在细胞裂解时保护磷酸化残基。

3》是否按照CST建议的操作方法进行实验?

首先，登陆我们的中文网站http://www.cst-c.com.cn, 在search的方框里输入您所需要的货号，然后就可以跳到这个产品的网页，在Applications一栏点击你所做的实验，再点击下面的protocol即可看到相关操作步骤。

4》刺激处理是否恰当？

要看看在你所研究的实验样本中，刺激的条件如何？举个例子：很多客户认为做磷酸化抗体，处理时间短了表达不出来，所以一处理就是2小时甚至6小时。但是不同的蛋白有不同的处理最佳时间，比如对P-IRS-1这个蛋白而言，我们通常用C2C12细胞系，建议处理insulin的时间为5分钟，浓度为100ng/ml。IRS-1蛋白是十分不稳定的，并且包含许多的丝氨酸磷酸化的位点，每一个磷酸化位点在insulin / IGF 信号通路中会形成不同的负反馈回路。很多情况下，单一磷酸化位点的表达水平都是比较低的，很难被检测出来，实验条件需要反复优化以得到阳性的结果。

再比如，像MMP系列蛋白，在大多数细胞裂解物中是很难检测的，因为它是一个高分泌的蛋白。很多时候人们用culture supernatant（培养上清液）来检测MMP系列蛋白，要用培养细胞的上清液来检测，因为细胞中的MMP蛋白会分泌到培养液中去。

5》抗体是否有问题？我们提供专门的细胞裂解物来检测抗体是否存在问题，这是最好和最快捷的方法。

登陆中文网站 http://www.cst-c.com.cn，在研究中点击下拉菜单“靶标的阳性对照”, 就可以转到下面的阳参列表。其中部分有商品化的对照，大家可以去购买。不论是商品化还是非商品化的对照，我们也都列出了阳性细胞系及所用的药物处理的浓度及时间，方便大家去自己制作。

希望这五方面会对你有所帮助，欢迎您提出宝贵意见。