不同的丘脑皮质回路是由组织损伤和抑郁样状态引起的痛觉超敏的基础
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张智课题组与中国科大附属第一医院（安徽省立医院）麻醉科李娟团队联合在Nature Neuroscience上发表了题为“Distinct thalamocortical circuits underlie allodynia induced by tissue injury and by depression-like states”的文章，发现抑郁情绪产生的躯体疼痛与组织损伤产生的疼痛存在不一样的丘脑-皮层神经环路基础。
疼痛刺激源于一组复杂且异质的病因、遗传和环境因素，这些因素以不同的组合共同参与特定的神经生物学过程。典型的身体疼痛可由物理因素引起，包括炎症活动和创伤，或者慢性精神病（例如抑郁症）。多方面的证据表明，慢性疼痛和抑郁症状在临床上经常出现，传统止痛药对大多数抑郁症患者的止痛效果不佳。这种治疗方法的差异意味着，情感因素引起的疼痛与组织损伤引起的疼痛有不同的机制，然而这些机制至今仍不清楚。
不管病因如何，神经系统的病理性神经可塑性都加剧疼痛的中枢致敏。许多大脑区域，如丘脑、杏仁核、前额叶皮质（PFC）和前扣带回皮质（ACC）参与慢性疼痛的中枢调节，其中大多数核团也与抑郁症相关行为有关。此外，在类似抑郁状态下的痛觉超敏小鼠模型中可以发现杏仁核中央核的可塑性失调→束旁核（PF）的回路，但在炎症或神经病理性疼痛的小鼠模型中没有发现。这种行为症状的多样性表明，离散的神经回路可能介导不同病因引起的疼痛，如组织损伤和负面情绪。
该团队以小鼠足底炎症和神经结扎作为组织损伤疼痛模型，综合运用病毒示踪、在体多通道/光纤记录和双光子钙成像等手段研究发现，丘脑后核（PO）投射至初级感觉皮层（S1）的神经环路（PO Glu→S1 Glu）参与组织损伤产生的痛敏。此外，慢性应激产生抑郁样行为的小鼠也表现出痛敏（作为抑郁症患者躯体疼痛的动物模型）。有意思的是，在该模型动物上，调控POGlu→S1Glu神经环路活性并不能影响痛敏行为，但却发现丘脑束旁核（PF）投射至前扣带回皮层（ACC）神经环路（PF Glu→ACC GABA→Glu）参与抑郁情绪产生的痛敏。
组织损伤相关痛觉超敏中POGlu神经元活性增强
使用完全弗氏佐剂（CFA）或诱导备用神经损伤（SNI）建立组织损伤相关痛觉超敏的小鼠模型。在前肢注射CFA（CFA 3D）后3天或SNI（SNI 7D）后7天，小鼠的痛阈显著降低，但小鼠并未变现抑郁样行为。
丘脑被认为是麻醉动物神经系统最高层次“伤害感受神经元”的主要来源。因此，研究丘脑不同亚核的神经活动，首先通过观察CFA 3D小鼠或SNI 7D小鼠中的c-Fos表达，发现PO（而非PF）、丘脑腹后内侧核（VPM）或丘脑腹后外侧核（VPL）中神经活动的即时早期基因标记物。免疫荧光染色显示约90%的c-Fos信号与谷氨酸特异性抗体共定位。表达CaMK2的Cre小鼠与Ai14小鼠杂交，产生表达番茄红的谷氨酸神经元（CaMK2–tdTom）。
在CFA 3D和SNI 7D小鼠中，脑切片中可视化谷氨酸能神经元的全细胞记录显示，来自PO的棘波数增加，rheobase减少，而非PF。这些离体数据表明，POGlu神经元，而不是PFGlu神经元，被神经炎症或损伤激活。此外，在CFA 7D和SNI 14D小鼠中观察到POGlu神经元活性增加，并未表现抑郁样行为。
为了研究POGlu神经元是否对阈下刺激敏感，在接受PO输注表达荧光Ca2+指示剂GCaMP6m（AAV-DIO–GCaMP6m）的腺相关病毒（AAV）的CaMK2 Cre小鼠中进行光纤光度记录。在0.07 g von Frey丝刺激后，Ca2+信号迅速在CFA 3D和SNI 7D小鼠受伤前肢上增加。行为学上，微量输注GABAA受体激动剂MUS快速灭活PO神经元可减少CFA 3D和SNI 7D小鼠的痛觉超敏反应。在接受PF输注MUS的小鼠中未观察到该结果。这些数据表明，在组织损伤条件下，POGlu神经元的兴奋性增强。
Fig 1. PO与组织损伤相关的痛觉超敏有关
抑郁样状态下PFGlu神经元兴奋性降低
通过慢性束缚应激（CRS）建立了抑郁相关的小鼠痛觉超敏反应或慢性不可预测压力（CUS）。在CRS（CRS 3W）后3周或CUS（CUS 10D）后10天内，小鼠在常规分析中表现出显著的超敏反应和多重抑郁样行为，包括社交互动试验（即社交区时间缩短）、悬尾实验（即，不动性增加）和强迫游泳试验（即不动性增加）；这些行为在CRS 3W后持续3周，在CUS 10D后持续7天。
实验结果表明，在目前的实验范式中，慢性应激后观察到的小鼠疼痛敏化出现抑郁样症状。
在CRS 3W小鼠或CUS 10D小鼠中，与对照小鼠进行比较，在脑切片中进行全细胞记录，结果显示接受CRS 3W或CUS 10D的Camk2–tdTom小鼠的PFGlu神经元的峰数减少，rheobase增加，但POGlu神经元没有增加。在体多通道电极记录证实了这一点。此外，MUS的PO输注对CRS 3W或CUS 10D小鼠的痛阈没有影响。慢性应激期间PFGlu神经元兴奋性降低表明丘脑不同亚核参与了组织损伤（PO）和抑郁样状态（PF）引起的超敏反应。
Fig 2. PF而不是PO，参与由抑郁样状态引起的痛觉超敏反应
POGlu→S1HLGlu的兴奋性通路
丘脑最显著的特征是它与大脑皮质相互联系。为确定这些区域间的疼痛相关通路，该团队研究了不同丘脑皮质回路的功能连接。
将表达Cre依赖性通道视紫红质-2（AAV-DIO–ChR2–mCherry）的AAV注入CaMK2 Cre小鼠的PO。三周后，在许多区域观察到mCherry+纤维，这与疼痛有关，但在ACC中不相关。
为确认PO–S1HL投射，研究人员将顺行单突触AAV-Cre–GFP病毒注射到C57小鼠的PO中，并将AAV-DIO–GFP病毒注射到S1HL中。三周后，在S1HL中观察到绿色荧光蛋白（GFP+）阳性的神经元，其主要与谷氨酸特异性抗体共定位。
为了表征PO–S1HL组织，采用了细胞类型特异性逆行跨单突触追踪系统。将Cre依赖性辅助病毒（AAV-EF1α-DIO-TVA–GFP和AAV-EF1α-DIO–RVG）注射到CaMK2 Cre小鼠的S1HL中。3周后，将狂犬病病毒（RV）EnvA伪型RV-ΔG–DsRed注射到同一部位。这些辅助病毒促进了单突触逆行RV传播。在丘脑、ZI、IC、S2和对侧S1中发现了强烈的DsRed标记神经元。另外DsRed+信号在PO中明显，但在PF中不明显，并且该信号与谷氨酸特异性抗体信号共定位。相反，在表达GAD2（编码GABA合成酶谷氨酸脱羧酶2的基因）的Cre小鼠中进行相同的追踪策略，在PO和PF中检测到很少的DsRed信号。
采用光遗传学实验检查POGlu的功能连接→S1HLGlu途径，并利用脑切片全细胞记录，在S1HL中短暂光刺激含ChR2的POGlu终末，可在S1HLGlu神经元中可靠地诱发兴奋性突触后电流（EPSC），该电流被AMPA受体拮抗剂-二硝基喹草酸-1H，4H）-二酮（DNQX）消除。此外，自由活动小鼠在体多通道电生理记录显示，S1HL中POGlu终末的光激活增加了S1HLGlu神经元的放电频率。这些数据表明POGlu神经元向S1HLGlu神经元发送单突触投射。
来自离体和在体电生理记录的数据表明，在CFA 3D和SNI 7D小鼠中，只有一部分POGlu神经元显示出增强的神经元活性。原因之一可能是记录的神经元中的剩余细胞没有投射到S1HLGlu神经元。为此，该团队用PO输注AAV-CaMK2a–mCherry和S1HL输注retro-AAV-CaMK2a–EGFP治疗小鼠，以标记前向S1HLGlu神经元注射的POGlu神经元。共表达mCherry和增强型GFP（EGFP）的POGlu神经元脑片中的全细胞记录显示了神经元活动的一致模式，包括CFA 3D小鼠和SNI 7D小鼠的棘波数增加和rheobase减少。此外，在接受PO输注AAV-DIO–ChR2–mCherry和S1HL输注retro-AAV-CaMK2a-Cre的小鼠的PO中进行在体多极记录，包括光刺激和无光刺激。仅选择光敏感神经元进行进一步的数据分析，发现蓝色光敏感PO神经元（推测为S1HLGlu投射POGlu神经元）的放电频率在CFA 3D小鼠和SNI 7D小鼠中显示出一致的增加模式。
Fig 3.POGlu→S1HLGlu通路的研究
POGlu→S1HLGlu通路在组织损伤相关性痛经中的作用
根据上述报告的结果假设，如果S1HL神经元在兴奋状态下由POGlu输入支配，那么在组织损伤条件下输入的增加应引起兴奋效应。脑切片中的免疫组织化学和全细胞记录显示，CFA 3D小鼠和SNI 7D小鼠的S1HLGlu神经元中的c-Fos表达和峰数均增加。在体电生理和光纤钙成像记录中也观察到S1HLGlu神经元的兴奋性增强。为了观察清醒小鼠的钙信号，将AAV-DIO–GCaMP6m病毒注射到CaMK2-Cre小鼠的S1HL中。在体双光子钙成像显示，在CFA 3D或SNI 7D处理后，小鼠中GCaMP6m标记的S1HLGlu神经元的荧光强度迅速增加。在CaMK2-Cre小鼠中，通过使用Cre依赖的化学发生抑制hM4Di病毒（AAV-DIO–hM4Di–mCherry）选择性抑制POGlu神经元和腹腔注射其配体氯氮平-N-氧化物（CNO）来消除这些效应。此外，S1HL输注hM4Di和腹腔注射CNO选择性抑制S1HLGlu神经元可减轻CFA 3D小鼠和SNI 7D小鼠的痛觉超敏。
鉴于POGlu的增加→S1HLGlu兴奋性输入在存在组织损伤的情况下，通过对该通路进行光学和化学遗传操作来评估疼痛表型发现，对POGlu神经元（而非PFGlu神经元）的化学遗传抑制显著逆转了CFA或SNI诱导的超敏反应。在CaMK2 Cre小鼠中，通过PO输注携带eNpHR（AAV-DIO–eNpHR–EYFP）的Cre依赖性AAV，通过光学抑制S1HL中的POGlu终末，也获得了类似的效果。在对照CaMK2 Cre小鼠中，PO输注Cre依赖的化学遗传兴奋性hM3Dq病毒（AAV-DIO–hM3Dq–mCherry）和腹腔注射CNO以选择性激活POGlu神经元导致痛阈降低。这些结果显示了POGlu的功能因果关系→S1HLGlu回路在组织损伤诱发的痛觉超敏中的作用。
Fig 4.The POGlu→S1HLGlu 控制组织损伤相关的痛觉超敏
所涉及的行为学
高架十字迷宫实验
啮齿类动物（例如大鼠、小鼠）有探究行为，放入高架十字迷宫后会主动探究开臂，但又惧怕开臂中髙悬敞开的环境。抗焦虑药物能够増加开臂探究活动，致焦虑剂则相反。以小鼠实验系统为例，包括2个35 cm×6 cm的相对开臂和2个35 cm×6 cm的相对闭臂，闭臂上部敞开，开臂四周均敞开，开臂与闭臂之间中央有一个5 cm×5 cm的相对开阔部。迷宫离地面高50 cm。将小鼠置于中央开阔部，头朝闭臂。行为分析软件记录5 min内小鼠进入开臂与闭臂的次数和两臂滞留的时间（以四肢全部入臂或出臂为标准）。计算小鼠进入开臂的次数与时间分别占总次数（两臂次数之和）和总时间（两臂滞留时间之和）的百分比（占比）。
原文链接：https：//doi.org/10.1038/s41593-021-00811-x
（山东中医药大学中医药与脑科学研究创新团队 邢影 供稿）
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