灵长类中利用病毒载体成功地向痛觉神经导入了基因 ~期待在神经障碍性疼痛治疗中的应用~

国立研究开发法人国立精神神经医疗研究中心( NCNP )神经研究所模式动物开发研究部的工藤もゑ技术专家、Sidikejiang Wupuer研究员、关和彦部长和京都大学灵长类研究所神经科学研究部门整合脑系统领域的井上谦一助教和高田昌彦教授等共同研究小组， 利用腺病毒载体( AAV )，成功地将基因选择性导入了小型灵长类动物——普通狨的痛觉神经。 慢性疼痛不仅是特定疾病的患者，也是很多乍一看很健康的人的烦恼。 根据过去的调查，据说每4名日本成人中就有1人患有某种慢性疼痛。 这个慢性疼痛的24%是“神经病性疼痛”，也就是身体感觉系统的损伤和疾病引起的疼痛。 神经病理性疼痛是一种在皮肤等不被刺激的情况下持续发生的疼痛，到现在为止还没有根本的治疗方法。 但是，如果使用目前正在广泛研究的基因治疗技术，也许能够根治神经障碍性疼痛。 例如，有可能在传达疼痛的末梢感觉神经(侵害接受神经)中选择性地导入治疗相关基因，抑制其活动。 但是，末梢神经中除了侵害接受神经以外，还混合了传达自己在运动的神经和传达触觉的神经，因此多年来只能向这种侵害接受神经选择性导入基因是不可能的，但近年来，有人提出了基因治疗技术，也许可以做到这一点。 也就是说，这是一种利用腺病毒载体将外源基因选择性导入侵害接受神经的技术。 虽然该技术有可能发展为创新型人类慢性疼痛治疗，但成功病例仅限于小鼠和大鼠等啮齿类动物，包括人类在内的灵长类尚未见报道。 本研究采用同样的基因导入方法，首次在世界范围内证明了灵长类动物(狨)也可以导入专门针对侵害接受神经的基因。 本研究的成果，有望发展成为针对为神经障碍性疼痛而烦恼的人类患者的、使用了腺病毒载体的新的基因治疗方法。 本研究成果于日本时间2021年8月8日21时27分刊登在“molecular therapy-methods & clinical development”在线版上。

研究背景

慢性疼痛不仅是各种疾病的患者共有的，是乍一看很健康的人大多数都会有的烦恼。 例如，过去的调查显示，每4名日本成年人中就有1人患有某种慢性疼痛。 而且，诉说慢性疼痛的人有24%是“神经障碍性疼痛”，也就是身体感觉系统的损伤和疾病引起的疼痛。 一旦患上这种神经障碍性疼痛，即使皮肤等不被刺激也会持续疼痛，但很遗憾，根本的治疗方法并不存在。 在这样的背景下，近年来，神经病理性疼痛的基因治疗方法正在被广泛研究。 因此，我们的目标是，在感知疼痛刺激的末梢感觉神经(侵害接受神经)中选择性地导入外源基因，通过抑制其活动来抑制疼痛。 但是，在末梢神经中，除了侵害接受神经以外，还混杂着传达自己在运动的神经和传达触觉的神经。 因此，很难只对侵害接受神经选择性地导入基因，是技术上的课题。 但是，最近有划时代的发现，利用腺病毒载体，外源基因可以有选择地导入侵害接受神经。 使用该技术，有可能有效治疗人类的慢性疼痛。 但是，到目前为止，这种选择性基因导入成功的例子仅限于老鼠和大鼠等啮齿类动物，没有包括人类在内的灵长类中成功的例子。

研究概要

研究小组为了向狨的感觉神经细胞导入基因，向坐骨神经注入了嵌入了荧光蛋白基因GFP的腺病毒( AAV )载体(图1A、b )。 为了与先行研究进行比较，对啮齿类的大鼠也进行了同样的实验。 已知AAV根据其类型不同而对不同的组织和细胞具有指向性(更容易优先感染的性质)，但已知特别是AAV6在啮齿类中对痛觉神经具有指向性。 因此，在实验中使用了AAV6和作为比较对象的具有触觉和肌肉感觉指向性的AAV9。 于是，确认了基因按照目的导入了感觉神经细胞(图1 C-F )。 另外，对向靶组织以外导入基因进行调查时，在比注入载体的部位更远的脊髓和注入周边的肌肉中，载体的导入量非常少，确认了对神经组织的高选择性(图1 G-I )。 接着，确认了感觉神经细胞中AAV6和AAV9各自的指向性，关于AAV6，狨也和大鼠一样具有无髓神经细胞的指向性，但关于AAV9，与对有髓神经细胞具有指向性的大鼠不同，在狨身上看不到方向性(图2 )。 在感觉神经细胞中，已知无髓神经主要与疼痛等痛觉相关，有髓神经与触觉和肌肉感觉相关。 并且，通过病理学检查，未发现炎症性细胞的浸润等，确认几乎没有受到AAV毒性的影响(图3 )。 最后，确认了感觉神经细胞信息传递目的地脊髓中AAV6和AAV9各自的指向性。 在脊髓中，也和感觉神经细胞一样，AAV6对狨和大鼠都具有无髓纤维的指向性。 另一方面，关于AAV9，大鼠的有髓纤维具有指向性，而狨的无髓纤维有指向性(图4 )。 结果显示，对于狨，选择AAV6的类型可以选择性地将基因导入痛觉神经(图5 )。 可以认为，此次我们成功导入灵长类痛觉神经选择性基因，是因为选择了病毒载体直接注入神经的给药途径。 在以往以灵长类为对象的研究中，大部分使用静脉给药和脑脊液给药，因此没有对痛觉神经获得选择性。 虽然不太清楚病毒载体通过血脑屏障向脑神经细胞导入基因的结构，但是推测出啮齿类和灵长类的这个结构有很大的差异。

今后的展望

由于向痛觉神经选择性导入基因的技术不仅在啮齿类动物中实现了，预计今后不再是导入技术，而是以通过导入什么样的基因能够更有效地抑制慢性疼痛为对象的开发研究将会盛行。 例如，通过引入抑制神经活动的治疗药物来抑制疼痛，以及使用目前正在积极研究的光遗传学和化学遗传学的治疗方法等，有望发展成许多治疗方法。 我们开发的方法目前需要直接注射到周围神经，所以缺点是技术难度大。 但是，基于这次的发现，通过临床上日常进行的向皮肤和肌肉的注射也可以期待同样的效果。 通过开发这种新的注入途径，有可能被确立为神经病理性疼痛治疗的最简便有效的方法之一。

图1:AAV载体的神经内注入

通过将嵌入了a、b ) GFP基因的AAV载体注入到狨的左侧坐骨神经，向感觉神经细胞进行基因导入。 C-F ) AAV载体注入1个月后脊髓和后根神经节(白箭头)中荧光蛋白基因GFP的表达实例。 G-I )向靶部位以外导入AAV载体非常少。 注入部位附近的脊髓( GFP+，h )和远位的脊髓( GFP-，I )，以及注入部位附近的肌肉(腓肠肌内侧头)和远位的肌肉(胫前肌)的AAV载体拷贝数的比较。

图2 :向感觉神经细胞导入荧光蛋白分子和导入指向性感觉神经细胞的基因的例子。 感觉神经细胞( NeuN，红色)和神

感觉神经细胞的基因导入例。 通过感觉神经细胞( NeuN，红色)和表示神经细胞中基因表达的荧光标记( GFP，绿色)的重叠，可以看出AAV6和AAV9载体都将荧光蛋白分子导入了神经细胞中( A-D )。 进而，将感觉神经细胞区分为有髓神经( E-E”、G-G“、I-I”、K-K“、红)和无髓神经( F-F”、H-H“、J-J”、L-L“、红)，分别进行区分 另一方面，在AAV9中，大鼠通过有髓神经导入较多基因，而在狨组中，有髓·无髓神经在基因导入上均未见优势差异( m，n )。

图3 :苏木精-曙红染色的病理学检查

以服用AAV9的狨( a，b )、大鼠( c )以及服用AAV6的狨( d，e )和大鼠( f )感觉神经细胞的苏木精-曙红染色为例。 与对侧的控制( g -狨、h大鼠)相比，细胞浸润的征兆未见显着差异。

图4 :荧光蛋白分子在脊髓的导入和定向

导入感觉神经细胞的荧光蛋白分子在感觉信息传递目的地脊髓也得到了确认(图4 )。

大鼠脊髓和狨脊髓中AAV6和AAV9的基因导入例。 在AAV6中，大鼠和狨都发现了基因导入到无髓的侵害感受性神经细胞中( e，I )，但是没有导入到有髓的躯体感觉相关的神经细胞中( f，j )。 另一方面，在AAV9中，发现大鼠在有髓神经中导入了基因( n )，但在狨中被导入了无髓神经的一部分( q )，没有被导入有髓神经。 另外，在脊髓前角发现运动神经元中有基因导入( g，k，o，s )。

图5 :向狨注入AAV6类型的载体后，可以选择性地向痛觉神经导入基因

用语解说

用语解说 腺病毒( AAV )载体: 被期待应用于基因治疗的基因导入载体(基因搬运工)之一。 据说只引起非常弱的免疫反应，不具有病原性。 具有可以向神经细胞等高效导入基因，基因表达长期持续的特征。 另外，已知根据AAV的类型分别具有对不同组织的指向性。 后根神经节: 将来自末梢感觉感受器的信号传递到中枢的感觉神经细胞的集合体。 温觉、触觉、肌肉感觉等不同种类的神经细胞聚集在一起。 感觉神经的轴突(从细胞延伸的细长突起)位于进入脊髓之前。

原论文信息

・論文名：” Specific gene expression in unmyelinated dorsal root ganglion neurons in nonhuman primates by intra-nerve injection of adeno-associated virus 6 vector”
・著者：工藤もゑこ、Sidikejiang Wupuer、藤原真紀、齊藤祐子、窪田慎治、井上謙一、高田昌彦、関和彦
・掲載誌：Molecular Therapy - Methods & Clinical Development
・DOI：10.1016/j.omtm.2021.07.009
・URL：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S232905012100126

资助金

本成果主要是在以下研究资助下进行的。 文部科学省科学研究费补助金jp19h 01092，19h 05724，19k 21825，JP17J05310 日本医疗研究开发机构JP20dm0307021，JP20dm0207077。

咨询方式。

【关于研究的咨询】

国立研究开发法人国立精神神经医疗研究中心 神经研究所模型动物开发研究部关和彦

TEL: [phone]
FAX: [phone]
E-mail: seki(a)ncnp.go.jp

【有关报道的咨询】

国立研究开发法人国立精神神经医疗研究中心 总务科宣传员

〒187-8551 東京都小平市小川東町4-1-1
TEL：[phone]（代表）　
FAX：[phone]
E-mail: ncnp-kouhou(a)ncnp.go.jp

京都大学总务部宣传科国际宣传室 〒606-8501

京都府京都市左京区吉田本町

TEL：[phone]　
FAX：[phone]
E-mail：comms(a)mail2.adm.kyoto-u.ac.jp

※使用※E-mail时，请将上述地址( a )的部分变更为@。