群体结构图形三剑客
重测序便宜了，群体的测序和分析也多了起来。群体结构分析，是重测序最常见的分析内容。群体结构分析应用十分广泛，首先其本身是群体进化关系分析里面最基础的分析内容，其次在进行GWAS分析的时候，本身也需要使用PCA或structure分析的结果作为协变量，来校正群体结构对关联分析带来的假阳性。
我们之所以冠以 “群体结构三剑客”的称呼，那是因为这三张图（或者说三项分析）几乎总是在一篇文章中一起出现。虽然这三张图常常一起出现，但它们能够解释的生物学问题，以及绘制的方法都是有所不同的，所以我们还是一一来解释。
2.1 PCA图（主成分分析）
颜值：☆ ☆
实用性：☆ ☆ ☆ ☆
PCA图形的解读
PCA分析是一项朴实无华的分析内容，但它应用十分广泛，的确能够帮助我们解决某些生物问题。说起朴实无华，是因为它的结果不花哨且及其容易看懂，仅仅是一张散点图而已。
比如，下图来自熊猫重测序的文章[1]，作者使用主成分1（principal component1）和主成分2作为X轴和Y轴绘制散点图，每个点代表1个样本。在这样的PCA图中，如果两个样本距离越远，则说明两个样本遗传背景差异越大。理想情况下，遗传背景相似的个体会在图中聚类在一起。
例如，这张图中涉及的熊猫个体分别来自3个不同的熊猫自然保护区。PCA分析的结果也将这些个体分为了3个亚群，和熊猫来源的地域信息完全一致。
图1 PCA分析将来自三个区的大熊猫准确区分开
但是如果你不仅仅满足于把图形基本信息读懂的话，你还是需要对PCA这一方法有初步的了解。PCA是一种线性代数中的数据处理方法，而这个方法的数学过程比较抽象，在这里有限的篇幅里不便展开讨论，感兴趣的同学可以自己百度查询。PCA分析应用的情境是：在某些情况下，我们数据实在过于复杂。
例如：对一个群体进行重测序，得到的SNP位点数是百万级别的。如果我们直接使用百万级别的SNP信息作为指标对个体进行区分，就会显得信息过于庞大而无法把握重点。PCA分析过程就是从这百万级别的信息中提取关键的信息，以便我们使用更少的变量（指标）就可以对样本进行有效区分。这些被提取出的信息，按照其效应从大到小排列，我们称之为主成分1（principal component1）、主成分2、主成分3… …
在实际文章中，我们不仅仅只使用PC1和PC2来对样本群体进行区分。从数学上理解，PCA分析的过程就是从大量数据指标中提取关键信息的过程。但PC1或PC2对总体信息的解释程度总是有限的。我们将之称为PCn对总体方差解释的百分比。一般重测序的PCA分析结果中，PC1对总体信息的解释比例在3~10%之间。所以，我们也需要关注一下其他主成分的分类效果。
例如在家蚕重测序文章中，分别使用主成分1和2绘图（左图）以及主成分3与主成分4绘图（右图）。两个聚类结果呈现了不同的意义。在PC1和PC2的聚类图中，将野生蚕和家蚕区分开了两个群体。而在PC3和PC4的聚类中，则分离出了两个来自江南地区高产丝量的品种。
所以，从生物学层面理解，PCA分析的过程就是信息浓缩的过程，会从原始的各个SNP位点信息中提取相似的信息，浓缩为新的变量PC1、PC2、PC3…. 输出。所以不同的主成分可能会（记住，仅仅是可能）对应不同的生物学意义，产生不同的聚类分类效果。
图2蚕群体利用不同主成分的聚类结果比较
在其他实际案例中的使用
PCA分析只是一种非常单纯的数学方法，具体有什么样的生物学意义还是需要具体问题具体分析。PCA分析在实际案例中应用主要包括：
1.检测离群样本
例如，在上图（右）中，两个高产的品种就属于离群样本。如果你材料已知都是来源同一品种的个体，这种离群样本可能就意味着在采样或测序过程中，出现了样本混淆。如果这些材料后续用于GWAS分析，个别样本出现离群则考虑要把这些离群样本剔除。当然，如果大量样本离群或出现群体分层（例如，上图的左图，明显分层为两个亚群体），则需要将PCA或structure分析的结果作为后续关联分析的协变量，校正它们对关联分析的影响。
2.推断亚群间的进化关系
例如下图这篇葡萄群体研究的文章[3]，研究的葡萄品种来源三个地域。绿色的西部葡萄和红色的东部葡萄区分比较明显，而蓝色的中部葡萄夹杂在东、西两个亚群间，和两个亚群有大量重叠。作者从中推断，东、西两个地域的葡萄都有传播到中部地区，并伴随大量杂交，导致中部地区的品种系谱比较混杂，并没有形成自己独立的亚群。其实本人作为小白鼠也做过基因型检测，PCA结果最后被归类到江南地区人群。当然我对结果一点也不意外，因为我是如假包换的大胡建人。
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图3 葡萄亚群体的基因混杂现象
PCA分析和绘制的方法
PCA分析只是一种统计方法，我们可以使用一些群体统计软件计算出群体中PC1~pCn的数值，然后绘制散点图就可以了（绘制散点图其实利用excel就可以完成。当然，使用R语言绘图的话，会更加美观一些）。
在群体分析软件上，我们推荐GCTA软件中的PCA模块来完成分析（http://cnsgenomics.com/software/gcta/pca.html）。这个软件有window版本，但和本地blast类似（我们之前分享过）只能在Dos界面下的命令行模式运行。当然还包括比较老牌的PCA分析软件EIGENSOFT（http://www.hsph.harvard.edu/alkes-price/software/），但这个软件只有linux版本。总之，在生物信息领域，软件大都不太友好，这也是这个行业的现状。
当然，PCA分析不仅仅用在重测序的领域，在RNA-seq、16s meta rDNA 测序也被大量使用，只是将上文提到的SNP信息替换为表达丰度了而已。如果你对RNA-seq，16s meta 测序的PCA分析感到头疼，其实可以直接使用我们基迪奥新开发的免费在线分析云工具（www.omicshare.com/tools/）。
被各种生物信息软件虐过的生物狗们一起团结起来，英特纳雄耐尔就一定要实现… … 感觉有点跑题，重新喊一次口号：欢迎被各种生物信息软件虐过的生物狗们多给我们反馈修改意见，OS tools 的用户友好程度一定会持续提高的。
参考文献：
【1】Zhao S, et al. (2013)Whole-genome sequencing of giant pandas provides insights into demographichistory and local adaptation. Nature genetics45(1):67-71.
【2】Xia Q, Guo Y, Zhang Z, et al.Complete resequencing of 40 genomes reveals domestication events and genes insilkworm (Bombyx)[J]. Science, 2009, 326(5951): 433-436.
【3】Myles S, Boyko A R, Owens C L, et al. Genetic structure and domesticationhistory of the grape[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011,108(9): 3530-3535.