高分生信+实验文献解读

目前的很多文章都是以组学分析开头+后续实验来进行构架的，其中组学分析的话，又以聚类相对来说不叫新一些，所以这次就给大家抄读一个类似的文章吧。这次抄读的文章是发表在19年发表在Elife的一篇文章。

基本结果

作者提出GLI2通过调控下游靶基因SPP1 (这个基因的蛋白为OPN) 表达使胰腺导管腺癌（PDAC）从经典型（classical）向基底型（basal-like）转变。并得到以下三个结论：

  1. 胰腺导管癌的亚型转变并非永久性，GLI2促使classical亚型向basal-like亚型转化。

  2. GLI2作为SPP1转录因子，促进SPP1转录，进一步提高骨桥蛋白（OPN）的表达，促进肿瘤转移生长并减少肿瘤对致癌性KRAS的依赖性。

  3. GLI2以及OPN的高表达是胰腺导管腺癌不良预后的标志。

实验结果解读

胰腺导管腺癌的classical和basal-like两种分型是由Moffitt提出，其基因表达谱类似于乳腺癌和膀胱癌的classical和basal-like分型。classical亚型上皮分化基因表达丰富，而basal-like亚型上皮间质转化（EMT）基因高表达，因此classical亚型患者较basal-like亚型患者具有更好的临床预后。GLI2是GLI家族中转录活性最强的转录因子（TF)是hedgehog（Hh）通路的下游,有研究表明Hh通路的配体sonic hedgehog（SHH）和Indian hedgehog（IHH）在正常胰腺组织中不表达，而当上皮损伤以及肿瘤形成时诱导Hh通路配体表达。

由于GLI2与Hh通路的紧密关系，作者首先探讨了GLI家族与Hh配体的关系，证实两者表达呈负相关。首先检测了Hh配体SHH和SMO以及GLI家族在14株胰腺癌细胞系中的基础表达量，以及GLI的转录活性，根据GLI表达情况及转录活性分成GLI高表达和低表达两组，确定KP4,miapaca和panc0327为GLI高表达细胞株（figure1A,B）。进一步的利用TCGA数据分析提示GLI2低表达和SHH高表达患者拥有更长的生存期(figure1D,E)。在组织和细胞层面均提示GLI与Hh受体的表达呈负相关。

考虑到这一过程在肿瘤侵袭过程中的作用，进一步探讨GLI表达与EMT以及basal-like亚型的关系。首先检测14株胰腺癌细胞系中上皮标志物和间质标志物的表达情况，与figure1A对比，GLI高表达的两个细胞株KP4和miapaca同时高表达间质标志物(Figure2A)。同时，间质标志物高表达细胞系classical亚型标志物低表达（figure2D）。EMT评分与GLI转录活性和SHH表达分析提示，EMT评分与GLI的转录活性呈正相关，与SHH表达呈负相关(Figure2B,C)。因此，得出高GLI表达伴随高间质标志物和低classical亚型标志物表达。

随后作者考虑GLI2在classical和basal-like亚型转换中起到怎样的作用？在classical亚型细胞株（YAPC和HPAFII）中过表达GLI2,导致间质和basal-like标志物表达升高而上皮和classical标志物表达降低（figure3A）。同时过表达GLI2后细胞失去上皮样形态变圆（figure3B）。作者利用基因编辑YAPC和HPAFII细胞株，构造doxycycline（DOX）诱导的GLI2表达细胞系(iGLI2 细胞)（figure2C），并且对DOX刺激下的YAPC-iGLI2和HPAFII-iGLI2进行basal-like和classical基因表达检测，结果显示GLI2表达后basal-like相关基因表达增加（figure2E）。同时干细胞标志物表达增加而SHH和classical标志物表达减少（figure2F,G）。这个结果提示，GLI2能够促进classical亚型向basal-like亚型转换。

作者进一步探讨GLI2在维持basal-like亚型中起到的作用。敲低basal-like亚型细胞株（KP4和panc0327）中GLI2和GLI1后basal-like标志物表达降低，classical和上皮标志物表达增加（figure4A,B,C）。同时，细胞获得上皮细胞形态（figure4D）。CRISPR-Cas9敲除basal-like亚型细胞株KP4中GLI2后，细胞增殖能力减弱，特别是在体内成瘤实验中更为明显（figure4F,G）。同时，basal-like的标志物表达减少，而classical标志物表达增多（figure4H）。

95%胰腺导管腺癌存在KRAS基因突变,近年来有研究提出胰腺导管癌细胞可以不依赖KRAS基因，通过激活其他旁路途径维持肿瘤生长，逃脱细胞凋亡，以此来减少对KRAS基因的依赖。因此作者假设由CLI2介导的classical亚型向basal-like亚型转换过程中可以消除对KRAS的依赖性。作者团队设计Dox诱导的Kras等位基因驱动的鼠PDAC模型（称为iKRAS模型）。iKRAS小鼠模型获得的细胞去DOX处理后，Kras消减后检测到GLI1和GLI2表达升高（figure5C）。在classical亚型细胞YAPC中敲减KRAS后GLI2,间质及basal-like标志物表达升高（figureD,E）。而使用GLI抑制剂后，由KRAS抑制引起的间质及basal-like标志物增加的现象被减弱（figure5F），此外，过表达GLI2能够挽救由去除Dox刺激引起的iKRAS细胞的生长抑制（figure5G）,以及敲除KRAS基因引起的YAPC细胞生长抑制（figure5H,I）。已经证实的非KRAS依赖旁路途径是通过YAP1，而作者验证E4-7逃逸细胞系不携带YAP1，而携带GLI2,因此提出GLI2可能是另一个非KRAS依赖旁路途径（figure5J）。

随后作者团队为了寻找GLI2的下游靶基因，对DOX诱导后YAPC-iGLI2细胞进行RNA-seq分析，表达最上调的转录物是编码骨桥蛋白（OPN）的分泌磷蛋白1（SPP1）（figure6A）,并进行了进一步验证，SSP1与GLI2表达呈正相关（figure6B,C,D）。在敲减KRAS后同样可以引起SPP1转录增加（figure6E）,而敲减GLI1和GLI2后SPP1转录降低(figure6G，H）。用OPN刺激classical亚型capan2细胞后basal-like亚型标志物增加（figure6I）。而在敲减GLI2的同时增加OPN刺激能够挽救GLI2敲减引起的basal-like标志物表达降低（figure6J）。CHIP实验提示SPP1是GLI2的靶基因。因此推断，GLI2作为转录因子与SPP1启动子区结合开启表达，促进OPN的表达，进而引起classical和basal-like亚型的转换。

最后，敲除SPP1后使细胞向上皮形态转化（figure7D），并且抑制肿瘤的增长（figure7E,F,G）,同时抑制肿瘤细胞的转移能力（figure7H，I）,并且延长小鼠的生存时间（figure7J）。

总的来说

作者在每一步的实验过程当中，都会加一部分RNA-seq的数据来进行分析来指导下一步实验的。同样的文章最关键的分子分型也是基于RNA-seq的数据来做的。而作者用的RNA-seq的数据来自于TCGA。所以说，其实数据分析那一部分，如果会相关的分析的话，其实我们也可以来做的，剩下的实验部分，那就考验自己实验技能了。

其中文献当中的富集用到了GSEA，关于富集的介绍和相关软件推荐可以见第二个和第三个帖子。

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