【LorMe周刊】乳酸发酵系统——合成菌群定向发酵中的万金油
作者：任鹏，南京农业大学硕士在读。主要研究根际资源与微生物互作。
相比于单菌，合成菌群因具有明确的分工和更高的效率而在生物质转化方面拥有更广的应用前景。在该研究中，作者设计一种乳酸发酵系统，并基于此系统实现由木质纤维素到中间产物乳酸，再由乳酸定向转化为短链脂肪酸（SCFAs）的过程。具体为木霉真菌首先降解木质纤维素并释放可溶性糖，随后兼性厌氧乳酸菌将不同的糖类物质集中发酵产生乳酸，最终由专性厌氧功能菌合成SCFAs。由于木霉和乳酸菌对氧气的利用为后续功能菌的生长创造了较低的氧化还原条件，因此合成菌群各成员在该系统中稳定共存。
Clostridium tyrobutyricum、Veillonella criceti以及Megasphaera elsdenii是SCFAs合成的关键功能微生物，但其直接利用糖类物质进行生物转化的效率较低。乳酸作为SCFAs的关键底物，利用乳酸菌（Lactobacillus pentosus）将不同的糖类集中发酵为乳酸或许可以起到桥接糖类物质到SCFAs的作用。不仅如此，木质纤维素作为糖类物质的重要来源，可由木霉真菌（Trichoderma reesei）分泌胞外酶降解获得，从而保证糖类物质的供应（图1A）。
理论上，将上述三类微生物进行组合可以实现由木质纤维素到SCFAs的定向转化，但不同微生物对非生物环境适应能力的差异性，尤其是对氧气需求的差异性直接限制了上述三种微生物的共存（图1B、1C）。因此，作者设计一种乳酸发酵系统，通过空间生态位的分割，具体为通过先后接种木霉和乳酸菌以降低氧气浓度，为最后SCFAs合成功能菌的生长创造无氧条件，从而实现三种微生物的共存和功能发挥（图1D、1E）。
文章中，首先接种真菌进行发酵，其次将接种乳酸菌的时间点定为0h点和第一阶段的起始点，并将接种功能菌作为第二阶段起始点。
图1 乳酸发酵系统设置
（A）合成菌群成员及分工合作产生SCFAs的代谢路径；（B，C）不同菌株对非生物环境的耐受范围和对溶解氧的需求；（D，E）乳酸发酵系统。
Clostridium tyrobutyricum是一株可以以乳酸和乙酸为底物产生丁酸的专性厌氧功能菌，因此作者探究了Trichoderma reesei、Lactobacillus pentosus和Clostridium tyrobutyricum组成的合成菌群在乳酸发酵系统中丁酸的合成效果。
研究发现，在整个发酵过程中，系统氧化还原电位基本保持在-300mV以下，基本满足Clostridium tyrobutyricum的生长需求；此外，乳酸和乙酸浓度呈先升高后降低的趋势，而丁酸浓度则在100h后不断增加，最终趋于稳定。上述现象说明，在第一阶段，Lactobacillus pentosus发酵糖类物质产生乳酸和乙酸，Clostridium tyrobutyricum则进一步将其转化为丁酸。值得注意的是，乙酸被完全消耗后，丁酸的合成也随之停止，作者猜测原因可能是Clostridium tyrobutyricum无法以乳酸作为唯一碳源合成丁酸（图2A）。
为了验证该猜想，作者在150h时向体系中加入乙酸，随后丁酸的浓度显著上升，该现象证实了上述猜想（图2B）。
额外添加乙酸虽然提高了终产物的浓度，但需要额外补充。为此，作者将菌株Lactobacillus brevis添加到体系中以产生更多的乙酸。结果发现，相比于对照，丁酸终浓度得到显著提高（图2C）。此外，后续的研究还指出，适当降低氧气的供给速率，可以将乙酸更完全地转化为丁酸，进一步提高终产物的产量（图2D）。
为了进一步优化发酵过程，研究以葡聚糖、木聚糖和乙酸混合物为模式底物并结合模型预测了底物组成对目标产物产量的影响（图2E）。不仅如此，根据模型结果选择葡聚糖和木聚糖最优混合比例作为发酵底物时发现，丁酸产量的实际值和理论值基本一致（图2F、2G）。以上结果说明该模型预测结果的准确性以及底物组成的不同会导致产量的差异性。
图2 乳酸发酵
（A-D）不同发酵参数对丁酸产量的影响；（E）基于模型预测的底物组成对丁酸产量的影响；（F）葡萄糖/乙酸最优混合比例下丁酸产量；（G）丁酸产量的理论值和观测值。
基于乳酸发酵系统，由Trichoderma reesei、Lactobacillus pentosus和Clostridium tyrobutyricum组成的合成菌群实现了丁酸的高浓度定向发酵。但该系统是否适用于其他合成菌群仍需进一步探究。
为此，作者选择功能菌Veillonella criceti和Megasphaera elsdenii（以乳酸和乙酸为底物合成各种SCFAs，图1A）分别代替Clostridium tyrobutyricum，以探究新的合成菌群能否在乳酸发酵系统中稳定共存并实现终产物的定向发酵。结果显示，新组合的合成菌群可以实现终产物的定向发酵且获得较高的产量，这表明乳酸发酵系统具有一定的普适性（图3）。
图3 SCFAs发酵
（A，B）：基于乳酸发酵系统的SCFAs发酵
通过上述研究，乳酸发酵系统可以将模式底物转变为不同的SCFAs，但对自然界中木质纤维素原料的发酵效果仍缺少关键性数据。因此，作者选取山毛榉作为原料，对乳酸发酵系统的实际应用效果进行了考察，结果如图4所示。数据显示，预处理后的山毛榉在乳酸发酵系统中经合成菌群转化可产生高浓度的SCFAs（图4A、4B）。
以上研究表明该系统的综合发酵生物工艺具有很好的实际应用效果。
图4 山毛榉到SCFAs的转化流程
（A）山毛榉预处理过程；（B）不同合成菌群下各种SCFAs的产量。
合成菌群的设计一般需要考虑复杂的互作关系和对非生物环境因素的耐受性，以协调不同成员之间分工合作，进而提高菌群的稳定性和功能。文章中，作者通过设计一种乳酸发酵系统，该系统将合成菌群的不同成员分配在不同的空间生态位中，在避免消极互作的同时也克服了不同微生物对氧气需求差异性的问题。不仅如此，该系统可以满足不同合成菌群稳定共存从而实现不同的功能，极大地迎合实际应用所需。
论文信息
原名：A heterogeneous microbial consortium producing short-chain fatty acids from lignocellulose
译名：木质纤维素合成短链脂肪酸的生物工艺
期刊：Science
发表时间：2020.8
通讯作者：Michael H. Studer
通讯作者单位：伯尔尼应用科学大学