靶向糖降解过程增强抗体药物的抗肿瘤免疫活性
免疫检查点抑制剂（ICI）疗法彻底改变了某些癌症的治疗方法。例如，阻断性抗PD-1、PD-L1和CTLA-4的抗体，已经可以根除一些患者的转移性肿瘤，从而实现了长期生存。虽然免疫激活疗法可以显著延长生存期，但大多数患者会出现耐药或复发，其初级和次级耐药的基本机制还没有很好地理解。其他免疫调节剂可能会有些帮助，包括替代性T细胞检查点（例如，TIM-3、LAG-3和A2AR）、先天性免疫受体和配体（例如CD47和SIRPα）以及酶（例如IDO和ADAR1）。其中一些靶点正在进行临床评估，通常与PD-1/PD-L1阻断剂联合使用。
大多数ICIs的目标蛋白在细胞表面的糖基化作为免疫抑制的介质最近引起了人们的兴趣。大量的文献证实糖基化改变是恶性肿瘤的标志。与癌症转化相关的糖基化的一个例子是含唾液酸的蛋白质和脂质（唾液酸聚糖）的增加，这种表型在小鼠模型中随着肿瘤的进展而加剧，并促进肿瘤的生长。更多的研究表明唾液酸通过多种机制抑制免疫激活并充当糖免疫检查点：阻止补体依赖性细胞毒性，通过Fas死亡受体抑制免疫介导的凋亡，掩蔽自然杀伤（NK）细胞受体NKG2D的免疫激活配体，防止钙网蛋白结合和随后的巨噬细胞清除以及直接结合唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec）受体。特别是免疫调节的Siglec-sialoglycan轴作为唾液酸诱导的肿瘤免疫抑制的一个重要介质而出现。
肿瘤细胞在细胞表面表达异常数量的唾液酸，唾液酸是一个带负电的糖分子家族，在糖蛋白和糖脂上覆盖聚糖链。肿瘤细胞上的唾液酸聚糖（sialoglycans）可参与肿瘤细胞-细胞外基质相互作用和肿瘤细胞-细胞间相互作用，它可以形成一种保护区域，以使肿瘤细胞免受免疫识别。过去几十年的研究表明唾液酸聚糖在肿瘤免疫逃避中的作用远远超出了抗原的掩蔽作用，唾液酸是一种有效的免疫调节糖。唾液酸聚糖的许多强免疫调节特性被认为是与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）的特异性相互作用。
Siglec受体家族与多种唾液酸聚糖结构结合，通常组合在一起，形成每个免疫细胞类别。八个家庭成员（Siglecs-3、5、6、7、8、9、10和11） 具有与PD-1同源的细胞内结构域，包括位于开关基序（ITSM）之前的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）。这些胞浆ITIM/ITSM结构域招募蛋白质酪氨酸磷酸酶，最终导致抑制信号传导和免疫细胞抑制。由此可以推测Siglec结合细胞表面唾液酸聚糖具有类似于PD-1与PD-L1的抑制作用。最近发现Siglec-9在肿瘤浸润性T细胞上上调，并与癌症患者的生存率降低相关。反过来，通过基因敲除或抑制肿瘤唾液酸合成而减少Siglec配体可增强免疫浸润并减少肿瘤生长。因此，唾液酸聚糖-siglec轴可能是肿瘤免疫抑制的重要贡献者，也是肿瘤免疫治疗的一个有吸引力的靶点。
唾液酸聚糖配体具有明显的化学异质性，可与多种细胞表面蛋白和脂质骨架融合。因此，配体隔离抗体的开发具有挑战性。这里设想了一种靶向降解策略，其中唾液酸裂解酶（sialidase）与HER2靶向抗体曲妥珠单抗融合，以肿瘤特异性方式催化降解唾液酸聚糖。
先前报道了一种抗体-唾液酸酶分子，T-Sia1，该分子由霍乱弧菌（VC）唾液酸酶与曲妥珠单抗重链偶联而成。尽管T-sia1在低剂量下能有效地从HER2+细胞中切割唾液酸聚糖，但该结合物也具有相当大的非曲妥珠单抗的活性，这归因于具有多价底物（包括细胞表面）的VC唾液酸酶的表观KM值较低。这一属性反映了VC唾液酸酶的两个凝集素结构域的结合能力，这两个区域使细胞表面结合独立于抗体靶点。
为了找出一种更合适的唾液酸酶，研究人员筛选了六种重组细菌和人唾液酸酶。最终选择了鼠伤寒沙门氏菌（ST）唾液酸酶NanH是因为其对多价靶标相对较高的KM值（mM范围）、增强的NK细胞介导的ADCC作用和稳定性。同时为了提高新抗体偶联药物的稳定性，试验人员采用了HIPS-共轭的偶联方式。体外试验证明，新的抗体偶联唾液酸酶药物T-Sia 2，降低了唾液酸酶的“脱靶”效应，同时将的“治疗窗口”从T-Sia 1的60倍增加到2000倍。
对于T-Sia 2的体内试验，试验人员选择了同基因小鼠EMT6乳腺癌模型，其中EMT6细胞系被设计成表达HER2，但在小鼠中仍然对曲妥珠单抗具有耐药性。在体外，ST-唾液酸酶可以裂解HER2+EMT6细胞上的唾液酸聚糖，导致与人和小鼠Siglec-Fc融合探针结合降低，以及T-sia2增强的人NK细胞介导的ADCC作用。
接下来，将HER2+EMT6细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）、曲妥珠单抗或T-Sia 2进行腹腔注射治疗。28天后，PBS和曲妥珠单抗治疗组的所有小鼠都达到了需要安乐死的肿瘤负荷。相反，与曲妥珠单抗或PBS相比，两种剂量的T-sia2可延长小鼠生存期至40d，并表现出明显的肿瘤生长延迟。在两个剂量的T-Sia 2之间没有观察到肿瘤生长的差异。用花生凝集素（PNA）对肿瘤悬浮液进行凝集素染色，该凝集素与唾液酸酶治疗暴露的半乳糖残基结合，与PBS-或曲妥珠单抗治疗的小鼠相比，在最终结合注射后13-23d可检测到的肿瘤标记增加。这些数据表明，T-sia2使小鼠肿瘤微环境（TME）去唾液酸化，减缓了EMT6肿瘤生长的进程。
为了更好地理解T-sia2抗肿瘤活性的机制，试验人员用与T-sia2相同的偶联策略合成了三个对照分子。第一种是T-sia2，其中唾液酸酶的亲核催化突变（Y→A），导致功能丧失（T-Sia-LOF）。第二种是同型对照人IgG1–唾液酸酶与抗体motavizumab结合物（同型Sia），靶向实验室小鼠中不存在的抗原（呼吸道合胞病毒），与曲妥珠单抗有87%的一致性。第三种是在曲妥珠单抗的Fcγ受体（FcγR）结合域中具有多个点突变的变体（ELLG→PVA-），它消除了免疫细胞上大多数效应剂FcγR相互作用，同时保持了大部分新生Fc受体（FcRn）的结合，因此维持天然抗体循环（T-FcX-Sia）。体外NK细胞介导的ADCC分析与几个HER2+细胞系的实验表明，T-Sia 2在诱导细胞死亡方面优于曲妥珠单抗。正如预期的那样，同型Sia对HER2+细胞的ADCC刺激无效，而T-FcX-Sia在体外对T-sia2细胞的ADCC活性有很大的降低。
随后，将抗体-唾液酸酶结合物注射到乳腺脂肪垫中携带HER2+EMT6肿瘤细胞的Balb/c小鼠中。与先前的小鼠实验一致，与PBS-和曲妥珠单抗治疗的小鼠相比，T-sia2治疗小鼠的生存期延长，肿瘤生长缓慢。T-Sia-LOF治疗小鼠的生存率和肿瘤生长与曲妥珠单抗或PBS治疗小鼠无显著差异，表明唾液酸酶活性介导治疗效果。T-sia2治疗的小鼠肿瘤生长出现轻微的早期延迟，这在T-FcX-Sia治疗的小鼠中并不明显；然而，两个治疗组之间的生存率没有显著差异（P=0.89）。早期肿瘤生长的差异提示T-sia2可能同时增强FcγR依赖性和非依赖性免疫应答；然而，T-FcX-Sia的强大生存优势表明T-sia2在体内的主要作用机制不依赖于通过增强ADCC或抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的抗体-Fcγ受体结合。
用同型Sia治疗的小鼠的肿瘤生长是不均匀的，死亡时肿瘤PNA凝集素染色也是不均匀的，这表明用高浓度10mg/kg的同型Sia治疗的小鼠在肿瘤中也有唾液酸聚糖降解。也许正因为如此，与曲妥珠单抗治疗的小鼠相比，同型Sia分子具有中等的有效性和延长的生存期（P=0.025）。这种分子在小鼠体内的有效性证实了T-FcX-Sia的研究结果，即T-sia2的主要作用机制不是由ADCC/ADCP介导的，因为在体外，同型Sia不介导NK细胞介导的ADCC。
为了进一步研究唾液酸酶暴露的影响，试验人员根据前面提到的抗体-唾液酸酶偶联药物分析了血细胞计数。第一次注射偶联药物后48小时，红细胞和白细胞计数与PBS治疗的对照组相当，而在用任何含有活性唾液酸酶的结构物治疗的小鼠中，血小板计数下降到平均每纳升血液157个血小板，可能是由肝脏中的去唾液酸糖蛋白受体介导的，该受体与暴露的半乳糖结合，导致血小板去唾液酸化。血小板减少是癌症治疗的常见症状，一些血小板丢失可能是ICI治疗的一个良好预后生物标志物。令人鼓舞的是，没有一种唾液酸酶偶联药物引起治疗小鼠体重下降或出现不健康迹象。
在生存终点收集PBS、曲妥珠单抗和T-sia2治疗小鼠的肿瘤，提取浸润免疫细胞并用流式细胞仪分析。与用PBS和曲妥珠单抗治疗的小鼠相比，用T-sia2治疗的小鼠的白细胞总数增加。此外，T-sia2治疗增加了CD8+T细胞与Treg细胞的比率，这是乳腺癌患者预后改善的一个指标。与PBS治疗小鼠相比，T-sia2治疗的肿瘤中的其他免疫标记物变化包括MHCII+肿瘤相关巨噬细胞的增加和CD206+肿瘤相关巨噬细胞的减少，这表明可能转向更具炎性的巨噬细胞极化。此外，T-sia2治疗的肿瘤增加了活化（CD69+）和细胞毒性（颗粒酶b+）的CD8+T和NK细胞。
最近的证据表明，Siglec-E（人Siglec-7/-9的小鼠同源物）是几种小鼠肿瘤模型（包括EMT6肿瘤模型）肿瘤浸润CD8+T细胞上的主要Siglec。因此Siglec-E可能是免疫抑制表型的一个主要因素，而破坏Siglec-E配体是T-sia2在小鼠体内作用的重要机制。由于目前还没有Siglec-E的完全拮抗性阻断抗体，研究人员在Siglec-E-/-的C57BL/6小鼠中测试了T-sia2。
HER2+B16D5细胞被皮下注射到野生型（WT）和Siglec-E-/-C57BL/6小鼠的侧腹。7d后，用T-sia2和T-Sia-LOF对照组治疗小鼠，并评估肿瘤生长情况。正如预期的那样，唾液酸聚糖降解药物T-sia2提高了小鼠存活率，并延缓了WT小鼠的肿瘤生长。在Siglec-E-/-小鼠中，T-sia2治疗没有明显优于T-Sia-LOF，这表明体内唾液酸聚糖降解的治疗效果在很大程度上取决于功能性Siglec-E的表达。相应地，与用T-Sia-LOF治疗的WT小鼠相比，Siglec-E-/-具有较慢的HER2+B16D5肿瘤生长和延长生存期，并且当用T-sia2治疗小鼠时，Siglec-E基因敲除没有明显的生存益处。
最后，用流式细胞术分析在WT小鼠中生长的HER2+B16D5肿瘤中的浸润性白细胞，以确定TME中表达Siglec-E的免疫细胞可能与免疫抑制表型有关。将生长在Siglec-E-/-小鼠（n=12）中的肿瘤作为阴性对照进行分析，平均17%的总白细胞（CD45+细胞）呈Siglec-E阳性。虽然在表达CD19+、CD3+或NK1.1+细胞（分别为B细胞、T细胞和NK细胞）的CD45+亚群中未检测到Siglec-E的表达，但大多数髓系细胞（CD11b+细胞）包括巨噬细胞、髓样树突状细胞、粒细胞和单核细胞，Siglec-E染色呈阳性。
T-sia2的作用是使TME脱唾液酸化，去除Siglec配体，从而增强ADCC。然而，我们观察到T-sia2仅在表达Siglec-E受体的小鼠中有效，该受体位于TME的髓系细胞上，并且T-sia2的表现与其ADCC/ADCP受损的控制分子T-FcX-Sia的表现大致相同。这些数据表明抗体效应器的功能对这些小鼠模型的治疗效果并不重要。许多其他免疫机制被抑制性Siglec信号所抑制，这些信号可能起作用，包括直接巨噬细胞吞噬功能、细胞因子生成和T细胞受体信号和效应器功能。T-sia2可提高CD8+T细胞/Treg比值，促进活化NK细胞和CD8+T细胞的增加。
虽然研究证明了T-sia2作为单一疗法的一些疗效，但是将来将靶向糖免疫检查点的抗体-唾液酸酶分子与更传统的ICI疗法或抗体偶联药物（ADC）相结合具有重要的前景。预计不久的将来，唾液酸聚糖编辑抗体疗法将被证明是一个强有力的工具，以更广泛的新的抗癌疗法走向临床。
参考文献：