血液甲基化这样研究发了11分！
您的SCI选刊助手！今天和大家分享的是一篇 11+分的学习笔记。该笔记谈到，通过对前列腺癌患者的血浆DNA进行下一代DNA测序（NGS）提取出血浆DNA的甲基化组与基因组，对转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）甲基化组进行主成分分析，从而可以分析mCRPC的甲基化特征，并探讨其在血浆中的临床实用性。题目：全基因组转移性前列腺癌的血浆DNA甲基化特征参考文献：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32149736/一、研究背景来自癌细胞的DNA与来自非癌细胞的DNA混合后可在癌症患者的血浆中进行循环。研究表明，对血浆DNA进行分析可为癌症患者提供治疗决策依据，同时，还有多项研究支持“血浆DNA可代表临床相关的转移灶”的观点。血浆DNA中的甲基化组信息由于其组织特异性可提供细胞成分信息与定量组织中的肿瘤成分。对于转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC），虽其基因组情况已有描述，但其血浆的甲基化组尚未得到广泛研究。二、分析流程
三、结果解读1. 探查血浆DNA甲基化组在mCRPC中的作用同时表征mCRPC血浆甲基化组与基因组，对血浆DNA进行了高覆盖率靶向或全基因组NGS检测，确定肿瘤分数与拷贝数状态。利用杂合单核苷酸多态性（SNP）的基因组信息推导肿瘤分数，以计算染色体8p21或21p22内的缺失丰度，而这些缺失被称为前列腺癌锚定病变，前列腺癌锚定病变在既往研究中已经被列为肿瘤分数的替代物。在给予 abiraterone 或 enzalutamide 治疗后30天内，收集了患者血浆（基线处），这些患者代表的是广泛的基因组确定的肿瘤分数以及整个疾病谱；而后，收集19名有放射学进展患者的血浆。最终基因组学确定的肿瘤分数的中位数与范围分别是（图1B） ：基线血浆 —— 0.41（0.04-0.89）进展血浆 —— 0.42（0.09-0.89）
图1B 基线血浆与进展血浆的肿瘤分数对比接着，对DNA进行了亚硫酸氢盐处理，并对550万个全基因组CpG位点进行了靶标富集NGS，而CpG位点选择是根据它们在癌症区域的参与程度或邻近程度。对其中39个血浆样本进行了靶向捕获，还对其中46个血浆样本进行了低通全基因组亚硫酸氢盐测序（LP-WGBS）。此外，还对15个白细胞样本进行了靶向亚硫酸氢盐NGS。既往研究表明，相邻的CpG甲基化模式常常呈高度相关。通过观察，启动子区域的甲基化片段主要是低甲基化的，而其他类别的则是高甲基化的（图1C上）；将基线血浆、进展血浆和健康志愿者血浆中的甲基化比率分布与白细胞DNA进行比较，可见血浆与白细胞样本之间存在显著差异，与健康志愿者（HV）相比，癌症患者（BL/PD）血浆样品中的差异更为明显（图1C下）。与先前的研究一致，即癌症基因组的特征在于更多的低甲基化事件，与健康志愿者的血浆相比，含癌症DNA和正常DNA的混合物的mCRPC血浆甲基化组的甲基化程度更高。
图1C 基线血浆、进展血浆与白细胞的甲基化率2. 以无偏分析获取肿瘤分数为血浆DNA甲基化差异的主要决定因素以无偏分析框架来探索基因组血浆甲基化变化的复杂性，再对16个基线血浆样本进行主成分分析（PCA）。结果表明，第一个主成分（PC1）可解释42%的差异（图2A），且与基因组决定的肿瘤分数的具有高度相关性（r=-0.96，P=1.3×10-10，图2B）。为研究使用AR靶向剂的资料是否能够影响PC1与肿瘤分数的关联，使用PCA特征向量预测进展血浆样本，以健康志愿者（肿瘤分数为0）与LNCaP前列腺癌细胞（肿瘤分数为100）作对照，结果表明，PC1与基因组决定的肿瘤分数间仍具有高度相关性（r=-0.94，P=1.3×10-18，图2C）
图2A-B 对基线血浆进行PCA的结果
图2C 以PC1预测进展血浆的结果3. 甲基化率可以作为肿瘤分数的替代指标为测试较少数据点的数据集中由NGS识别的特征，比如甲基化阵列，学习笔记中假设以组分特征中最密切相关的区段的甲基化率的中位数作为肿瘤分数的替代指标。而后观察到，当包含10-10000个片段时，负相关组与正相关组的中位甲基化率与基因组决定的肿瘤分数间存在高度相关性（r=0.93）。同样，当包含更多片段时再进行观察，发现最高相关组分片段中甲基化率的样品内方差逐渐增加。证明了确实可以以甲基化率作为肿瘤分数的替代指标。选择与PC1相关性最高的1000个片段并命名为ct-MethSig。而后确认ct-MethSig 中位甲基化率与肿瘤分数具有高度相关性（图3B）：负相关区域或ct-MethSig的高甲基化组中的520个片段：r = 0.95，P = 8.4×10-19；正相关区域或ct-MethSig的低甲基化组中的480个片段：r = –0.93，P = 3×10–16。不包含甲基化状态的ct-MethSig 是组织中前列腺癌的基因，因为与这些基因重叠的片段与PC1值的相关性弱。此外，在已经发表的组织数据集中测试以上发现，可以证实两者（负相关区域与正相关区域）在mCRPC（高甲基化组：r = 0.92，P <1.5×10-6；低甲基化组：r = –0.74，P <1.4×10^–3）和激素敏感性前列腺癌（HSPC）（高甲基化组：r = 0.91，P <10–60；低甲基化组：r = –0.61，P <10–17）均与肿瘤纯度高度相关（补充图S9）。
图3B ct-MethSig 中位甲基化率与肿瘤分数具有高度相关性
补充图S9 ct-MethSig的两组分与mCRPC的肿瘤纯度高度相关4. 功能富集鉴定了循环前列腺癌DNA中的阻聚复合物2靶标的高甲基化对与ct-MethSig片段重叠的基因进行了基因集富集分析（GSEA），发现对阻聚复合物2（PRC2）的靶标进行了显著富集（P<10-4）。以往的mRNA图谱研究表明，前列腺癌和非癌性前列腺上皮的区别在于下调了PRC2抑制的基因。此外，这些基因仅存在于ct-MethSig的高甲基化组中，代表甲基化率随肿瘤分数的增加而增加。进行置换测试的结果表明，与1000个随机选择的基因组片段相比，PRC2调控的组分在ct-MethSig中含量更高。同时，在这些基因上游的启动子中发现高甲基化，为它们的下调提供了生物学解释，并由此提出将这种生物学差异扩展到液体活检应用的策略。5. 循环中的肿瘤甲基化特征包括对正常上皮或恶性前列腺上皮具特异性的区段假设ct-MethSig包括对恶性或非恶性前列腺上皮具有特异性的成分。在非恶性前列腺上皮细胞（PrEC）系的全基因组亚硫酸氢盐测序数据中绘制了ct-MethSig甲基化比率的核密度估计值，观察到存在双峰分布（LNCaP与健康志愿者）。因此，根据前列腺癌细胞系LNCaP与2个健康志愿者血浆样本中ct-MethSig片段的甲基化率对高斯混合模型进行了调整，然后在正常的PrEC上使用了拟合的高斯分布。在PrEC中鉴定出其甲基化比率分布与LNCaP或健康志愿者血浆一致的区段。结果表明，在正常前列腺上皮中与LNCaP相似的甲基化比率的片段是正常前列腺上皮特异性的，而与健康志愿者血浆相似的甲基化比率的片段是前列腺癌特异性的（图3D）。以上发现通过显示CRPC转移（包括归因于正常和癌性前列腺上皮的区段）得到证实，而正常前列腺仅仅归因于正常前列腺上皮的区段。根据结果可将ct-MethSig分为2个成分，循环的前列腺癌特异性信号和正常的前列腺特异性信号。最后，使用来自TCGA的553个前列腺癌和Beltran等人的12个CRPC腺癌的甲基化微阵列数据来表明，ct-MethSig片段在局部前列腺癌和CRPC组织中的分布包括癌症和正常成分。
图3D 对ct-MethSig的分析结果6. 个体癌症的特定甲基化标记接下来，对血浆DNA甲基化变化进行研究，因为这些变化有可能识别出不同的甲基化亚型。PC3上显示它与肿瘤分数的相关性很弱（r=0.01，P = 0.96），因此，与应用于ct-MethSig的方法类似，确定与该组件的值最相关的前1000个组分，但结果是相反的，它们主要呈正相关（图4A）。使用每个部分的中位甲基化率，能够合并来自中等风险HSPC与mCRPC活检组织基于阵列的甲基化数据。结果表明：与HSPC或白细胞相比，CRPC血浆和肿瘤样品的中位甲基化率呈现出更大的变异性（图4B）。与ct-MethSig相比，治疗前后肿瘤分数的变化并未改变与PC3相关的高相关片段的中位甲基化率（图4C）。对于尸检中从同一患者身上采集的多处转移灶样本和血浆样本，显示出患者间差异大于患者内差异（图4D）。
图4A-B PC3分析结果
图4C-E 对与PC3相关组分的甲基化率及两种样本对比7. AR-MethSig亚甲基化和AR拷贝数增加密切相关对PC3的前1000个片段的功能富集分析显示组蛋白H3三甲基化标记物富集。假设该甲基化特征受一个常见转录通路调控，从而搜索了与前1000个片段的起点的75个碱基对内相邻的已知转录因子结合位点（TFBS），发现AR结合基序是唯一显著过量的结合位点（局部富集P = 6×10–4，全局富集P = 3×10–16，图4E），将此基序标记为AR-MethSig。接下来，在LP-WGS中提取了全基因组拷贝数分布图，确认使用或未使用亚硫酸氢盐处理的相同样品的结果之间具有高度相似性。使用血浆样品中的LP-WGBS可以观察到拷贝数变化的频率与先前描述的mCRPC组织或血浆的研究一致。随着PC1值的增加，存在更多的拷贝数变化，因为增加的肿瘤分数改善了拷贝数检测（补充图S15）。此外，确认ct-MethSig或AR-MethSig在拷贝数更改的区域中定位的频率不高。为整合具有特定甲基化特征的基因组拷贝数数据，评估了基因组中每个片段的拷贝数与PC1值的相关性。在比较AR拷贝数增益样本与AR拷贝数未增益样本时，发现PC3值的分布存在显著差异（P = 0.018）。考虑到PC3值与AR拷贝数之间的相关性，可以由此证实具有AR增益的患者血浆和组织样品的AR-MethSig甲基化率明显低于AR拷贝数正常样品。
补充图S15 PC1值增加与拷贝数变化情况8. AR调节性甲基化标记可识别不同的临床表型使用高覆盖率靶向NGS和LP-WGBS两种方式提取的AR-MethSig的中位甲基化率高度一致，再次支持了LP-WGBS的使用，这也提示：LP-WGBS在临床上有助于对患者进行基于甲基化的分层。除此以外，在激素敏感性癌症的AR-MethSig中没有发现低中位甲基化率，同时，两种常用的AR调节的前列腺癌细胞系（LNCaP和VCaP）的AR-MethSig中亦不存在低中位甲基化率这一情况。由于没有观察到AR-MethSig中位甲基化率随时间的变化，因此在评估AR-MethSig的临床相关性时，选择了与疾病无关的固定时间点（与采样时间无关）：即从ADT（雄激素阻断治疗）开始直至死亡的时间。结果表示，AR-MethSig低度癌症的临床预后较差（图4G）。
图4G AR-MethSig高度与低度生存分析结果小结在mCRPC的研究中揭示了血浆DNA的甲基化特征，对ct-MethSig进行两分（恶性与非恶性），研究PC3并最终根据AR-MethSig对患者进行了生存分析。学习笔记记录其新颖之处在于仅使用mCRPC血浆DNA以及多种肿瘤部分构建模型。综上所述，血浆甲基化可能是补充或替代基因组测试的重要信息来源，利用血浆DNA的甲基化特征来跟踪mCRPC的DNA并且可鉴定具有独特生物学机制和不同临床结果的mCPRC亚型。学术交流群加小编，请备注: 单位+研究方向
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