Molecular Cell：以色列著名学者破译RNA编辑的规则
最近，由以色列魏茨曼科学研究所Schraga Schwartz教授领导的研究团队通过大规模系统分析破译了ADAR1酶如何选择其靶点。
ADAR1作为一种重要的RNA编辑酶，催化了人类转录组上数千个位点的A-to-I RNA编辑。尽管人们已经从多个角度研究了ADAR1，但对其底物选择的规则仍然知之甚少。最近，由以色列魏茨曼科学研究所Schraga Schwartz教授领导的研究团队通过大规模系统分析破译了ADAR1酶如何选择其靶点。
这篇题为“Deciphering the principles of the RNA editing code via large-scale systematic probing”的论文近日发表在《Molecular Cell》杂志上，有望提高ADAR1介导的mRNA编辑的效率，从而促进其在治疗背景下的应用。
众所周知，RNA分子在结构上类似于DNA分子，都是由四种不同的碱基组成，但与DNA不同的是，它们的寿命有限，且大多是单链的。某些以双链形式存在的RNA分子有时会被ADAR1修饰，将腺苷（A）脱氨成为肌苷（I），这可能是为了将细胞自身的双链RNA与病毒的双链RNA区分开来。
从生理学、生物工程和治疗角度来看，ADAR1引起了科学家浓厚的兴趣。不过，他们还不大了解A-to-I RNA编辑背后的基本规则，比如双链RNA中的哪些位点被编辑，以及编辑到什么水平。考虑到mRNA靶向编辑为纠正单核苷酸突变提供了一种更安全的替代方法，解析A-to-I编辑背后的规则就变得至关重要。
ADAR1底物的系统筛选
为了系统地揭示A-to-I编辑的决定因素，研究人员设计出两种双链发夹结构报告序列：B2和mNG构建体。之后，他们在此基础上设计出一个寡核苷酸文库，大约含有2,000条不同的RNA变体，并委托Twist Bioscience公司合成（图1）。他们随后将合成的变体导入人体细胞系，等待几小时让ADAR1完成其工作，然后寻找RNA编辑的变化。
图1. 寡核苷酸文库的序列组合
Twist寡核苷酸池是利用其专有的硅基DNA编写技术合成的高度多样化的单链寡核苷酸（ssDNA）集合。
▪ 寡核苷酸长达 300 nt，适合更多的应用条件
▪ 无与伦比的均一性
▪ 极高的精度和准确度
▪ 极低的错误率，不超过 1:2000 bp
▪ 在同一引物池内，对特异寡核苷酸的数量没有限制
定向且对称的RNA编辑
研究人员观察到，结构破坏上游35 bp和下游30 bp处的编辑水平显著增加（图2）。3 bp错配大大增加了-35和+30编辑水平。在-35位置，所有细胞系的倍数变化中位数是1.5-4.9倍，而在+30位置，倍数变化中位数是1.4-2.6倍。即使1 bp错配，对编辑水平也有显著影响。同时，在破坏位置和两个峰之间的区域形成了强烈的波谷，表明该区域对编辑具有抵抗力。他们还观察到，这种峰和谷的模式是周期性的，尽管幅度有所衰减。
图2. 在结构破坏的上游35 bp和下游 30 bp处诱导编辑
对于上游35 bp和下游30 bp之间的5-bp偏移，研究人员表现出了浓厚的兴趣。他们假设了两种模型，并通过实验进行了验证。结果表明，ADAR1感知其相对于RNA链的相对方向，在破坏位点的上游35 bp和下游30 bp引入编辑。这说明编辑是定向而且对称的，偏移量为5-bp，并且上游（-35）的信号比下游（+30）强得多。
提高RNA靶向编辑的效率
为了进一步测试这种编辑规则的适用性，他们通过招募内源性ADAR1来进行可编程的RNA编辑。他们设计了靶向SMAD4基因的151-nt mRNA，并在距离靶向腺苷35 bp处设计了4-nt错配。与预期一致，错配的引入使HEK293T细胞的编辑效率提高了3倍，从4%提高到12%。
图3. ADAR1介导的A-to-I编辑的模型
总的来说，研究人员提出了一个定向、对称、周期性且循环的RNA编辑模型（图3）。ADAR1酶首先识别轻微结构破坏并编辑其上游35 bp处。接着，它开始编辑相反的链，有5-bp偏移。在这一步，他们提出了三种可能的编辑机制。之后，ADAR1识别编辑事件引入的新结构破坏，并再次编辑上游35 bp，以此往复。当编辑的位点不再处于双链RNA结构中时，编辑终止。
这项研究破译了RNA编辑的基本规则，加深了我们对RNA修饰的理解。RNA分子的寿命很短，它们引入的变化将是短暂的，因此，RNA编辑比永久改变DNA的编辑更加安全。未来，它有望用于纠正遗传病中存在的一些常见突变，包括囊性纤维化等。
参考文献
Deciphering the principles of the RNA editing code via large-scale systematic probing