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胃癌中RNA加工因子的综合特性确定了一个预测临床结果和治疗反应的预后模型。
背景：RNA加工将初级转录RNA转化为成熟RNA。改变的RNA加工驱动肿瘤的发生和发展，并可能产生新的治疗机会。然而，RNA加工因子在胃癌(GC)中的作用尚不清楚。
在本研究中，构建并验证RNA加工因子相关的预后模型，将RNA加工因子相关预后模型与年龄和肿瘤分期相结合构建一个综合列线图以促进临床实践。最后分析该模型与临床结果、遗传变异、激活途径、免疫异质性和药物反应特征之间的关系，以及与胃癌风险分层相关的可变剪接事件，并识别相应的功能。
1、五种RNA加工模式的鉴定
在本研究，作者采用无监督聚类分析对患者进行分类，根据RNA加工因子的表达识别了5种不同的RNA加工模式，且生存分析显示总生存期差异显著（图1A-C）。GSVA富集评分阐明5个聚类之间的生物学功能和通路差异(图1D）。
结论：RNA加工因子在胃癌的发生发展中起重要作用。
图1
2、RNA加工相关预后模型的构建
单因素Cox比例风险回归分析筛选出105个与预后相关的RNA加工因子，并对其进行KEGG和GO功能富集分析以研究其生物学功能(图2A)。LASSO回归进一步识别出10个核心基因构建RNA加工相关的模型(图2B-D)。模型将患者分为高、低危组，生存分析显示低风险评分患者的整体生存时间明显长于高危评分患者(图2E-G)，单变量和多变量Cox回归分析结果表明该模型是重要的独立预后因素。
图2
3、综合列线图的识别
Cox比例风险回归整合年龄、TNM分期和RNA 加工相关预后模型建立综合列线图(图3A)。通过RMS曲线、时间依赖性ROC分析、校准曲线和决策曲线分析(DCA)来评价综合列线图的性能，以及内外验证集(HMU和GEO)验证该列线图的临床预后能力，结果表明该综合列线图具有可靠性和稳定性(图3B-M)。
图3
4、预后模型基因的功能分析
鉴于RNA加工因子是控制真核生物RNA生命周期的主要因素，故随后评估了被RNA加工相关预后模型影响的RNA表达谱。作者将RNA加工相关模型风险评分与所有稳健表达的mRNA相关联，生成一个按Pearson相关系数排序的预排序列表，WGCNA分析识别出5个模块，其中3个模块与模型风险评分显著相关(图4B-C)，结果提示模块中基因可能有重要生物学作用与RNA加工相关的预后模型相关。最后作者对每个模块中的基因进行了功能富集分析，结果表明RNA加工相关的预后模型反映了GC中涉及多个重要特征(侵袭、转移、增殖、代谢、免疫应答)的基因表达改变。
图4
5、RNA加工相关预后模型的表达和临床特征
差异表达分析提示10个预后模型RNA加工因子在两个风险组的表达具有显著差异(图5A-B)，免疫组化分析其中7个预后相关RAN加工因子在肿瘤组织和正常组织中的的蛋白表达(图5c)。此外，作者还对TNM分级和5个不同RNA加工模块在高低风险组的分布进行分析，晚期肿瘤(III期和IV期)在高危组显著富集(图5A,D)。高危组在预后差和间质激活不良的1和5聚类模块的比例更高(图5A,E)。这些结果提示所鉴定的RNA加工因子可能参与了GC的发生和发展，并可能作为潜在的治疗靶点。
图5
6、RNA加工相关预后模型的遗传变异、途径激活和免疫异质性
作者分析TCGA-STAD数据集的突变谱和体细胞拷贝数改变(SCNA)数据，发现与高危组相比，低危组的肿瘤突变负荷(TMB)明显增高(图6A)，并且更多的突变导致更多的新抗原（图6A-B)。通过创建突变景观发现两组之间有25个显著突变基因(图6C)。对SCNA事件相关数据分析低、高危组染色体改变模式(图6D)，发现在低风险组中检测到更大比例的基因获得[6] (图6E)。
GSVA证实基质和免疫激活途径在高危组中显著富集(图7A)。肿瘤和正常组织中基质和免疫细胞浸润情况分析结果证实高危组的基质和免疫评分均显著更高(图7B, C)。另外MRP计数器算法[7] 结果也和之前一致(图7B, D)。通过HE染色分析可知高风险组肿瘤浸润淋巴细胞更高(图7E)。因此，肿瘤微环境中基质和免疫成分的激活，以及基于上述预后模型的致癌通路激活可能是高危患者预后较差的原因。
图6
图7
7、RNA加工相关预后模型的RNA剪接
从TCGA SpliceSeq数据库下载TCGA-STAD队列相应的可变RNA剪接数据，数据集中的剪接事件被分为7类。可变剪接事件（ASEs）经过严格筛选和量化后，作者对不同风险评分的GC样本中的ASEs进行了综合表征，发现随着风险的增加，检测到的ASEs总数逐渐减少。
在GC样本中根据高低风险评分，作者鉴定了差异表达的RNA加工基因和PSI值有显著差异的ASEs(图8B)，然后对具有不同PSI值的代表性ASEs进行分析，发现这些基因被不同剪接(图8C)。有差异剪接的基因GO分析表明不同的ASEs参与多种癌症相关通路。
通过CytoscApe软件为RNA加工基因和ASEs构建了一个包含549个两两相关的网络，结果显示大多数RNA加工基因与超过1个ASE相关，而且扮演相反的角色在调节不同的ASEs(图8D)。
图8
8、基于RNA加工相关预后模型的药物反应特征
TIDE算法确定低风险评分患者比高风险评分患者更有可能对免疫治疗产生反应(图9A、C)。基于三个公开药物敏感性数据库GDSC、CTRP、PRISM，差异分析高、低危组对7种常见化疗药物反应，使用bridge回归估计每个样本的剂量-反应曲线(AUC)值鉴别有显著差异的化疗药物。结果显示低风险评分的患者对两种CPRP衍生化合物(5-氟尿嘧啶和紫杉醇)更敏感，而高风险评分的患者对两种GDSC衍生化合物(伊立替康和顺铂)更敏感(图9A, B, D)。
图9
本研究发现RNA加工因子的一般表达模式与胃癌（GC）的特定临床结局相关，识别了与GC患者预后显著相关的RNA加工因子。构建了一个包含10基因的RNA加工相关的预后模型，与临床特征相结合，建立综合列线图，验证证明其能准确预测GC患者的预后。最后，该研究确定了与预后模型相关的临床结果、遗传变异、途径激活、免疫异质性、可变剪接景观和药物反应特征。