PCR成功的小技巧

由于每个实验室、每台PCR仪的实际条件不同，因此即使是被验证过的PCR体系，在不同的实验室中可能也会有不成功的情况。

以下几点Tips也许可以帮你：

• 设计特异性高的引物。设计引物时，要进行BLAST比对，从而尽量排除非特异性PCR产物出现的可能。

• 找到最适宜的退火温度。一般可以通过梯度PCR的方法，对退火条件进行摸索。退火温度梯度可以设为引物对Tm值上下5 ℃。Tm计算公式为：Tm = 4℃(G+C)+ 2℃(A+T)。如果没有扩增到预期的条带，可以降低退火温度帮助引物更有效地结合。如果非特异性条带很多，则可以提高退火温度来消除非特异性引物结合。

• 多引物对的PCR不成功时，需要分开优化。如果PCR体系中存在多对引物同时反应，而最终未能扩增到PCR产物，那么要对每个引物对进行单独的PCR反应，从而调整优化整个体系。

• DNA过多或过少都会导致PCR不成功。一般模板浓度控制在50-100ng/µl 比较合适。

• 使用合适的PCR 酶。不同的 PCR 产物 GC 含量不一样，遇见 GC 含量很高的产物往往常规的 PCR 酶没法做出很好的结果。一般在定制的基因工程小鼠鉴定方案中会指出适合的 PCR 酶的货号，按照已验证的方案以及推荐的酶体系，一般不会出错。