CRISPR/Cas9技术背景介绍及其操作流程

CRISPR/Cas系统全称为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated proteins)。这一系统是源于细菌中的一种后天免疫系统（图1）。该系统可以把侵入细菌的噬菌体遗传物质整合到自身基因组一个或者多个CRISPR位点作为永久的“记忆”，当细菌被再次入侵的时候，CRISPR位点被转录生成CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA随后会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切入侵的外源核酸序列，消灭外来遗传物质，发挥保护功能（图2）。简而言之，源于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术被工程化为一段介导定位作用的RNA序列（guide RNA和crRNA合二为一的杂合RNA序列，称为sgRNA）加上一个DNA水解酶Cas9组成的二元系统。

CRISPR/Cas系统来源于细菌的“免疫系统”

细菌利用CRISPR/Cas系统攻击噬菌体入侵示意图

研究者把这一系统工程化成可以用于编辑哺乳动物细胞的CRISPR/Cas9系统。具体包括适于哺乳动物表达的Cas9基因和定位作用的sgRNA（图3）。方便起见，研究者把这两者放在了一个载体之中（all in one plasmid）。如果计划利用这一系统编辑某个目的基因，我们唯一要做的就是定制一条有效的sgRNA。

工程化的CRISPR/Cas系统。该系统是个二元系统：负责切割的Cas9核酸酶和定位用的guide RNA （sgRNA）

这一革命性的基因编辑技术极其强大，可以在一般的分子实验室进行基因的敲除（KO）、基因组片段的删除、碱基位点矫正、大片段的敲入（KI）等操作。

一、   CIRISPR操作流程

1、 建立基因敲除细胞系流程

1.1 确定基因名称及其物种，选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系；

1.2 设计定制gRNA;

1.3 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体；

1.4 gRNA表达载体切割活性检测；

1.5 构建KO细胞系

2、 基因组片段删除流程

1.1 确定要删除的片段，选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系；

1.2 针对删除片段两段合适的位置各设计定制一条gRNA;

1.3 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体；

1.4 gRNA表达载体切割活性检测；

1.5 构建片段删除细胞系。

3、碱基位点矫正流程

1.1选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系；

1.2在需要矫正碱基位点或其附近设计定制gRNA;

1.3 设计合成Donor模板；

1.4 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体；

1.5 gRNA表达载体切割活性检测；

1.6 构建点矫正的细胞系。

4、大片段敲入流程

1.1选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系；

1.2在需要敲入的位点或其附近设计定制gRNA;

1.3 设计构建同源重组模板载体；

1.4 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体；

1.5 gRNA表达载体切割活性检测；

1.6 gRNA表达载体和同源重组模板共转染目的细胞构建点矫正的细胞系。