浅析痒觉的中枢环路机制（附VisuScratch动物抓挠行为分析软件介绍）
痒觉是一种诱发抓挠行为的不愉快的感受。近年来, 我们对痒觉信息在脊髓水平处理的分子和细胞机制已经有了较为深入的认识。然而, 痒觉信息如何从脊髓传递到大脑并不清楚。我们发现, 在痒觉诱发抓挠的过程中, 脊髓中投射到臂旁核的神经元被激活, 光遗传学抑制这条环 路的活性可以减少痒觉诱发的抓挠行为。脊髓中痒觉特异的胃泌素释放肽受体阳性神经元与投射 到臂旁核的脊髓投射神经元形成兴奋性突触连接。我们进一步研究了臂旁核在痒觉行为过程中的 活性变化和功能。我们发现, 臂旁核神经元的兴奋性与痒觉诱发的抓挠过程具有很强的相关性。整体抑制臂旁核神经元的活性或者选择性阻断兴奋性神经元的突触传递可以显著降低急性痒引起 的抓挠行为, 并减缓慢性痒模型的建立。我们的工作揭示了痒觉从脊髓传递到大脑的一条重要环路, 并且提示臂旁核是参与痒觉信息处理的重要脑区。该研究为深入阐明痒觉信息加工的脑内环 路机制提供了重要基础。
抓挠行为测试
为自动评估抓挠行为，在麻醉(戊巴比妥钠，0.1 g/kg)下将一个磁铁(直径1 mm，长度3 mm)植入每只小鼠的右后爪背部，至少在行为测试前7天进行(31)。腹腔注射头孢曲松钠(0.1g/kg)预防感染。在行为测试前，每天在右后颈剃刮小鼠并单独处理5天。小鼠皮内或鞘内注射生理盐水，然后在最后三天期间用记录室适应30 min。在行为实验过程中，使用磁感应法在线圈包围的圆柱形室(高20-cm，直径15-cm)中记录基线15 min。然后，将小鼠从室中短暂取出，并向右侧皮内注射瘙痒性化合物、组胺(500 μg/50 μl)、氯喹(200 μg/50 μl)、化合物48/80 (100 μg/50 μl)或内皮素-1 (25 ng/50 μl)、5-HT (10 μg/50 μl)、HTMT (0.1 μmol/50 μl)、氯本丙酚(0.1 μmol/50 μl)。鞘内注射铃蟾肽(0.2 nmol/10 μl)。对于铃蟾肽，仅分析了右后爪的抓挠行为，甚至动物用双后爪抓挠。使用按照既定方法定制的记录系统，使用磁感应法在注射后30-90 min记录抓挠行为(31)。在Matlab中用自定义代码分析了划痕行为。
在一些实验中，用高速摄像机(120 Hz)对抓挠行为进行录像，同时用磁感应法进行记录。手动分析了擦伤行为，以与磁感应法获得的结果进行比较。
过敏性瘙痒
在瘙痒过敏模型(32)中，加入卵清蛋白(50 g)和ImjectTM明矾
将佐剂(2 mg)溶于250 l磷酸盐缓冲液(PBS)中，并腹膜内注射，用于首次致敏。第2次致敏10天后进行同样的处理。1周后，颈背右侧皮内注射卵清蛋白50 g/50 l，记录抓挠行为30 min。
慢性瘙痒
将100 μl的1-氟-2，4-二硝基苯(DNFB)丙酮溶液(0.1%)涂在小鼠剃后的腹部皮肤上，用于初始致敏。用50μl(0.1%)DNFB丙酮溶液反复涂片，在致敏小鼠颈部右侧夹背处诱发皮肤反应。从初始致敏后7天开始，每周重复两次DNFB攻击，持续4周，共9次。DNFB绘画后1小时或24小时记录抓挠行为。
伤害性行为
在行为测试之前，动物在行为室适应至少两天。如前所述进行行为测试(33)。为了测试机械敏感性，用一系列具有对数递增刚度(0.16-2.56克)的von Frey毛发垂直刺激小鼠后爪。采用上下法测定50%爪缩回阈值(34)。
为了检查热痛，使用哈格里夫斯仪器，将对有害热刺激的爪缩回潜伏期确定为5分钟试验期内每个爪至少四次测量的平均值，并设定20秒的截止时间以避免组织损伤。
对于尾部浸入试验，用棉线手套轻轻束缚小鼠。然后将突出的三分之一尾巴浸入50°c水浴中。记录甩尾潜伏期，截止时间为10秒，避免组织损伤。
野外试验
如前所述(35)，在(40 × 40 × 40 cm)聚苯乙烯围封物中，通过10分钟(或15分钟)的开放场试验评估小鼠的运动活性。将小鼠放在盒子的中央，并分别对其进行录像。中心区域定义为中心20 x 20 cm。使用LabState对轨迹进行分析。分析了在中心区域行驶的总距离(cm)和时间。为了检查脊髓-轴通路的光遗传抑制对小鼠运动活动的影响，对小鼠进行了15分钟的试验(包括5分钟关灯期、5分钟开灯期和5分钟关灯期)。在光开启阶段，双侧提供恒定激光(593 nm，8-10 mW)。其他野外试验采用10分钟程序。
旋转杆
在前两天，将小鼠放在转速为5-20转/分钟(r.p.m)的旋转杆装置上5 min，并训练其保持平衡行走。第三天，rod加速到下午5-40点。并且小鼠被测试两次，最大时间为300秒。记录动物脱落的潜伏期。
平衡木实验
为了评估感觉运动控制，我们使用了如前所述的平衡木测试(36)。使用了两种类型的1米长的梁:6毫米，12毫米宽。本次试验连续3天:训练2天，测试1天。在前2天，鼓励每只小鼠穿过12-mm梁3次，穿过6-mm梁3次，间隔时间最短为10-min。在试验日，对每束(无光阑)的两次成功试验进行了分析并录像(用于进一步的离线分析)。测量穿过中心80 cm的持续时间。
尾部悬挂试验
用尾巴从杠杆上悬吊一只小鼠，并对动物的运动进行6分钟的录像。由对治疗不闻不问的观察者分析最后3分钟的不动持续时间。
强迫游泳试验
如前所述进行强迫游泳试验(37)。将动物放入盛有水(15 cm深，24-25 C)的聚苯乙烯圆筒(20cm高，15 cm直径)中。对动物进行6 min的录像。不动的定义是缺乏游泳和一条腿的最小运动。试验最后4分钟内的不动持续时间以双盲方式手动评分。
抓挠行为分析
为测量抓挠行为，采用磁感应法记录后爪的运动信号。当小鼠移动植入小磁铁的右后爪时，观察到大幅度波动。波动信号来自抓挠和其他后爪运动(例如。行走、跳跃)。抓挠行为会引发一系列电流波动，表现出周期性特征，每个周期对应一个后爪运动，以下称为抓挠事件。几个连续的抓挠事件对应于一次行为性抓挠回合。为了检测抓挠行为，我们使用定制的程序对运动信号进行分析。以大于整个运动信号标准差3倍的波动作为运动事件，以运动事件峰值的时间点作为运动事件时间。在抓挠过程中，我们对运动信号进行了傅里叶变换。抓挠引起的运动事件与其他运动引起的运动事件具有不同的时间结构。为了提取抓挠事件，我们首先将所有运动事件作为潜在的抓挠事件。在拾取每个潜在擦伤事件的时间点后，计算擦伤事件间隔时间(ISEI)的分布。我们发现ISEI分布在对数尺度上呈双峰分布。在双峰ISEI分布中，两个峰值位于65 ms和723 ms处，分别代表一次抓挠回合中抓挠事件之间的平均间隔和抓挠回合之间的平均间隔。位于216 ms和ISEI大部分地区(96%)的两个峰值之间的最小值小于2秒。基于上述分析和先前的报告(31)，我们采用以下标准从小鼠的运动信号中提取抓挠行为:1)两次连续抓挠事件之间的间隔应为0.02-0.2 s (5-50 Hz)。2)一次抓挠比赛应至少包括3次抓挠事件。由其他后爪运动(例如。行走、跳跃)通过应用这些标准而被排除。将间隔时间小于2秒的一系列抓挠发作定义为抓挠训练。通过定制的图形用户界面程序进行手动调整，以拾取遗漏的擦伤事件并删除错误的擦伤事件。然后自动计算抓挠次数。
文章来源
Mu D, Deng J, Liu KF, Wu ZY, Shi YF, Guo WM, Mao QQ, Liu XJ, Li H, Sun YG. A central neural circuit for itch sensation. Science. 2017 Aug 18;357(6352):695-699. doi: 10.1126/science.aaf4918. PMID: 28818946.
如果您也对动物实验感兴趣，欢迎关注和推荐关注 知乎账号：脑声常谈 和 微信公众号：bioviewer，专注于动物神经科学与行为学的实验知识的方法传播与分享交流，您可以推荐给您身边的朋友、同学以及老师，我们会定期更新您需要的相关实验方法的视频和文章，希望能对大家带来帮助！
附：VisuScratch动物抓挠行为分析软件
上海欣软信息科技有限公司自主开发的VisuScratch抓挠行为视频分析软件，是一种基于自动化图像识别的动物痒行为人工智能分析系统，通过机器学习、图像识别技术、特征行为抓取算法共同实现动物抓挠行为的自动化、高准确率的分析。
系统特点：
1. 客观地量化和评估抓挠行为。
2. 实时分析可以显著减少分析时间和人力成本。
3. 使用定制二次开发的图像算法摄像机，高精度测量分析。
4. 缩略图功能便于直观的后续分析。
5. 实验动物无压力环境（图像分析，使用不可见的近红外光）
6. 不需要对动物进行预处理。（非侵入性）
7. 消耗品基本上是不需要的。（我们建议根据测量时间使用保水凝胶）
8. 可以连续记录和分析抓挠行为长达 24 小时。
9. 可以选配输入输出功能，与光遗传、钙成像等第三方设备同步记录。
10.软件支持快速、慢速及正常回放三种模式，方便客户校准核对。
测试指标：
抓挠回合数、抓挠时长、抓挠次数、抓挠强度