文献精读：地下微生物网络变化与橄榄黄萎病不同耐受水平之间的联系

地下微生物网络变化与橄榄黄萎病不同耐受水平之间的联系

Linking belowground microbial networkchanges to different tolerance leveltowards Verticillium wilt of olive

译者：五谷杂粮

Microbiome [IF：10.13]2020-02-01  Articlesdoi: https://doi.org/10.1186/s40168-020-0787-2全文可开放获取 https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-0787-2第一作者：Antonio J. Fernández-González 和 Martina Cardoni其他作者：Carmen Gómez-Lama Cabanás² , Antonio Valverde-Corredor2² ,Pablo J. Villadas1¹ , Manuel Fernández-López¹ 通讯作者：Jesús Mercado-Blanco² [e-mail]

主要作者单位：¹ Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos, EstaciónExperimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas(CSIC), Calle Profesor Albareda 1, 18008 Granada, Spain.² Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Campus ‘Alameda del Obispo’ s/n, Avd. Menéndez Pidal s/n, 14004 Córdoba, Spain

摘要：

Background【背景】橄榄黄萎病（VWO）是由土传真菌病原菌Verticillium dahliae（黄萎病）引起的。采用耐/抗病的橄榄品种是管理VWO的最佳措施之一。对橄榄相关的微生物菌群及其与生物耐受性潜在关系的了解几乎为零。本工作的目的：（1）描述两个橄榄品种（耐受（Frantoio）和易感（Picual）VWO）的地下（根内和根际）微生物群落的结构、功能和共生相互作用；（2）评估这些群落能否解释不同疾黄萎病感染水平间的差异。【结果】无论是否接种了V. dahliae，两个橄榄品种与根相关菌群的α和β多样性间仅有微小差异。然而，未接种V. dahliae的植物群落在分类学组成上存在显著差异，Frantoio品种的相关有益微生物丰度较高，而Picual品种的的潜在有害微生物丰度较高。接种V. dahliae后，Picual在分类学水平上有显著变化， 并且菌群的互作网络，正负相关数量等也发生的巨大的改变。在根内，Frantoio群落向高连接度和低模块化网络转变，Picual群落则表现出截然不同的行为。在根际，V. dahliae仅出现在Picual的微生物网络。【结论】两个橄榄品种的地下微生物群落非常相似，病原菌的引入并没有引起其结构和功能的显著改变；而在接种V. dahliae后，它们的网络产生了显著差异。这种现象在根内群落中更为明显。因此，发现了该微生境的微生物网络的与对土传病原体的的敏感性/耐受性之间的相关性。此外，V. dahliae入侵Picual的微生物网络表明，接种对Picual的地下微生物群落有更大的影响。结果表明，共现相互作用的变化可能解释（至少部分解释）供试橄榄品种的VWO敏感性差异。【关键词】微生物功能群落，微生物结构群落，橄榄，根际，根内，Verticillium dahliae，抗病性，共现网络

背景

橄榄（Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea）是全球温带地区最重要的林木作物之一。它构成了与南欧（西班牙、希腊和意大利为主要生产国）紧密相关的农业生态系统，该地区集中了全球61.8％的橄榄产量，其次是非洲（17.9％）、亚洲（16.9）及美洲（2.8％）[1]。但是，一些传统的和新出现的病原体可能危及作为战略商品的橄榄种植的未来，特别是在地中海盆地。橄榄黄萎病(VWO)，由土传真菌Verticillium dahliae Kleb.引起，被认为是许多橄榄种植地区最具破坏性的疾病之一[2]。此外，由于多种原因（在其他地方得到全面和严格的审查），这种疾病很难控制[2，3]。在其他流行病学因素中，VWO攻击的严重程度取决于感染该树的V. dahliae的毒力。传统上，感染橄榄的V. dahliae菌株分为落叶型（D）和非落叶型（ND）两种致病型。D型病原体(1A谱系)具有高毒性，通常会引起严重的萎蔫综合征，包括萎黄病、绿叶脱落(落叶)和树木死亡。总体而言，D型菌株比ND型菌株的毒力更强，D型代表菌株会严重影响耐ND型菌种的橄榄品种。因此，在许多橄榄栽培地区当前的植物病理学情况下，建议实施VWO的综合管理策略，因为没有任何一种单一的控制措施在单独应用时是有效的。

使用耐/抗橄榄品种被认为是最有效的控制手段之一。确实，种植有耐性的或野生的橄榄品种(O. europaea subsp. europaea var. sylvestris Brot.)（与易感品种相比，可以抵抗V. dahliae感染而不出现严重的疾病症状），可以在育种计划中替代死树作为砧木或VWO抗性来源。不幸的是，迄今为止，还没有橄榄品种对VWO具有完全抗性的报道。对VWO的耐/抗性研究主要集中在对V. dahliae有不同抗性的橄榄品种的生化、生理或遗传和完整转录组上。虽然已经对橄榄相关微生物菌群的特定有益成分进行了研究，但其中一些旨在分离和表征针对VWO的生防剂（BCA），只有很少的例子研究整个土著橄榄的微生物菌群及其与生物约束敏感性的潜在关系。最近，我们描述了在相同的气候、农学和土壤条件下，在没有V. dahliae压力的情况下，来自不同地理区域的橄榄品种的地下微生物群落。与植物相关的微生物群落是决定植物健康和生产力的关键因素之一，它们有助于养分的利用和吸收、增强抗逆性、提供抗病性，促进生物多样性。有趣的是，某些植物在不同的土壤中生长时具有相似的群落，而同一物种的不同基因型或品种可以拥有不同的根系微生物群落，这表明植物基因型对其根相关微生物群落的组成至关重要。植物选择并塑造地下微生物群落，通过一系列机制刺激或抑制土著微生物菌落的某些成员，这些成员可以作为抵抗土传病原体的第一道防线。根系相关微生物群落的结构、组成和功能不仅受寄主植物基因型、适应性和物候学的影响，而且还受土壤健康的影响。例如，最近发现健康烟草土壤的细菌和真菌群落与青枯病（Ralstonia solanacearum）侵染的土壤有很大不同，从而得出以下假设：健康土壤具有较高的有益微生物丰度，从而改善土壤养分，促进植物生长，并控制土壤传播疾病。

微生物群落很复杂，由许多可能相互作用的类群组成。因此，微生物群落的功能并不等于其各个组分的总和。在这些群落中，微生物可以参与各种各样的关系：积极的（例如，合作生成生物膜，使其成员产生抗生素耐药性），消极的（例如，抗生作用或对资源的竞争），或中性的。对微生物之间建立的关联进行深入分析，可能有助于确定其环境生态位，揭示其在群落中的功能，确定生态系统的功能/稳定性。网络分析是研究一组项目(如微生物)的数学、统计和结构特性及其之间的联系的有用工具。最近，一种基于评价类群间共生关系的新方法，强调了正负生物学关系，最近被用于研究从人类肠道到海洋和土壤等复杂环境中微生物之间的共生模式。共生模式无处不在，可能是由具有相似或互补功能的物种或基因造成的，也可能是由微生物物种共存的共同环境条件造成的。生物信息网络和共现分析为我们提供了一个关于微生物相互作用模式复杂性的概念，但它们并不适合揭示这些相互作用的本质。尽管有这样的局限性，微生物网络的分析仍然是进行假设的重要工具。然而，特定类型微生物相互作用的存在及其对种群动态或功能的影响需要在相关的模型系统中进行验证。此外，技术手段，如采用稳定同位素进行实验，或荧光原位杂交，以及共聚焦激光扫描显微镜（FISH-CLSM）与双重培养测定法相结合，对于验证这些假设非常有用。

对表现出不同VWO反应的橄榄树品种的根相关菌群的结构、组成、功能和动力学的准确了解，有助于了解这些微生物群落是否以及在多大程度上有助于宿主对V. dahliae的耐受性/敏感性。此外，根据这一基本信息，可以在综合疾病管理框架内设想并开发更有效、更全面的VWO控制方法，如：基于微生物的生物控制策略；或鉴于耐药品种的相关微生物区系进行抗病育种。因此，这项工作的主要目标是：（1）描述与橄榄品种Frantoio（耐VWO）和Picual（易感VWO）相关的地下（根内和根际）微生物群落的结构(DNA水平)和功能(RNA水平)；（2）接种D型V. dahliae（高毒）后，评估两个橄榄品种相关微生物群落在组成和活性方面的变化；（3）通过网络分析，评估在V. dahliae存在下，两个橄榄品种的根内和根际微生物相互作用可能的差异变化。待测试的假设是：（1）橄榄品种的VWO耐受水平与其根微生物群的组成、结构、功能（潜在活性微生物[33]）方面的差异有关；（2）V. dahliae的存在改变并重组了橄榄根微生物网络，这可能有助于解释橄榄品种对VWO的耐性水平。

结果

Results

测序数据的一般特描述

General characteristics of sequencing datasets

通过对所有样本进行高通量测序，共获得了7,749,457个(细菌)和6,919,278个(真菌)原始reads。聚类后，最终仅保留了4189,961(细菌)和4829,128(真菌)的高质量reads。为避免对多样性的高估，舍弃了小于0.005％高质量reads的OUT（操作分类单元）。因此，最终得到1437个细菌OTU和504个真菌OTU。为比较α多样性，分别对每个域（细菌和真菌）、每种核酸（DNA和RNA）和每个区室（根际和根内）的最小样本进行稀疏处理。最后，448个样本中的443个OTU（表S1）（Good’s coverage覆盖率> 96.64%）被保留用于下游分析。【接种Verticillium dahliae之前，“Picual”和“Frantoio”的地下微生物群落解析】比较两个微生境（根内和根际）的丰度（可观察的OTUs）和逆辛普森（InvSimpson）α多样性指数，结果显示根际数据集高于根内。对α多样性指数的Kruskal-Wallis检验表明，细菌群落之间存在显著差异，而真菌群落之间无显著差异(表1)。比较来自相同微生境（根内和根际）、但不同群落（结构[DNA]和功能[RNA]）的数据集发现，除了根内微生物群落（细菌和真菌）之间的α多样性指数比较外，在大多数病例中都发现了显著差异。对于所检测的橄榄品种(Picual和Frantoio)，除了Picual植株的功能性(RNA)根际细菌群落的丰富度和多样性显著增加外，其他方面均无差异(表1)。在实验过程中，对每个数据集进行比较时，还发现了一些差异。然而，在每个时间点比较样本时，没有发现品种之间的差异(数据未显示)。关于β多样性并聚焦微生物群落动态（即OTU相对丰度随时间的变化），主要区别仅在于初始时间（T0）和分析的其余时间点（8、15和30天）之间，而与品种、微生境、核酸或微生物域无关。唯一的例外是Frantoio植株的结构(DNA)根内群落 (表2)。此外，比较两个品种在不同时间点的细菌群落时，几乎无差异。相反，Picual和Frantoio植株的根内真菌群落之间有显著差异。这种差异随时间保持不变(表2)。根内细菌群落以Actinobacteria（放线菌）、Proteobacteria（变形菌）和Bacteroidetes（拟杆菌）为主(占序列的74% ~ 97%；图1a，b）。有趣的是，Picual的结构(DNA)和功能(RNA)群落中Candidatus Saccharibacteria的相对丰度均显著高于Frantoio (p值< 0.01)。该门在功能（RNA）群落中的相对丰度较低，在“其他”群落中也有分布(图1b)。相反，与Picual相比，Frantoio的功能（RNA）群落中Proteobacteria和Verrucomicrobia的相对丰度显著较高(p值分别为0.007和0.02)。在细菌群落动态中发现了一些差异，但通常不一致（不超过一个时间点），或者随时间变化趋势不明显（数据未显示）。根内真菌群落的优势门为Ascomycota（子囊菌门）, Glomeromycota（球囊菌门）和 Basidiomycota（担子菌门）(所有样本中序列均>90%；图1c, d)。在任何采样时间点，均未发现品种间的差异。然而，Basidiomycota（担子菌门）的减少伴随着Glomeromycota（球囊菌门）的增加(图1d)，尽管这种趋势在任何一个门上都没有统计学意义。此外，在比较结构(DNA)和功能(RNA)群落时，Ascomycota（子囊菌门）和Glomeromycota（球囊菌门）的患病率呈倒排分布(图1c)。根际细菌群落的优势门为Proteobacteria（变形菌门）和Acidobacteria（酸杆菌门），其次为Bacteroidetes（拟杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）和Gemmatimonadetes（芽单胞菌门），占序列的88%以上（图2a，b）。与根内样本相似，Picual的结构（DNA）和功能（RNA）群落中的Candidatus Saccharibacteria均明显高于Frantoio（(p < 0.03）。此外，Frantoio的功能（RNA）群落中Proteobacteria（变形菌门）的丰度显著高于Picual（(p = 0.027）。就真菌群落而言，在结构（DNA）和功能（RNA）群落中，Ascomycota（子囊菌门）都是优势门。同样，在根内群落中，Glomeromycota（球囊菌门）在功能（RNA）群落中的丰度高于结构（DNA）群落。然而，平均起来，该门在这个微生境中的丰度并未超过Ascomycota（子囊菌门）（图2c，d）。当比较两个品种的功能（RNA）群落时发现，Picual中仅Chytridiomycota（壶菌门）的丰度显著高于Frantoio（(p = 0.042）（图2d）。

表1 α多样性指数的p值揭示了温室栽培的橄榄品种中特定微生境细菌群落的显著差异

表2 定量β多样性指数的PERMANOVAs表明，橄榄品种和处理之间存在相似的微生物群落

接种 D型 Verticillium dahlia后， “Picual” 和 “Frantoio” 的地下微生物群落的变化

Unraveling the belowground microbiota of “Picual” and“Frantoio” prior to the inoculation with Verticilliumdahliae

当比较未接种（对照）与接种V. dahliae的数据集（每个品种在每个微生境和每个核酸中）时，未检测到α多样性指数的差异。唯一的例外是接种V. dahliae后Frantoio根内功能（RNA）细菌群落的丰度下降。对栖息于该品种根内的结构（DNA）真菌群落中也观察到了同样的结果（表1）。关于β多样性，在接种V. dahliae后，根内微生物群落没有发现差异（表2）。该比较仅显示Frantoio在T15（接种15天后；dai）的根际微生物群落中有显著差异（成对Adonis p < 0.001），而在Picual中却没有。必须强调的是，由于在群落动态中仅观察到不一致和微小的变化（见上一节），因此本研究用三个采样时间点（T8、T15和T30 dai）的平均值对两个品种的未接种和接种V. dahliae的植物的微生物谱进行了比较。关于根内细菌群落，当比较未接种和接种V. dahliae的样品时，只有Frantoio的Actinobacteria（放线菌门）和Picual的 Acidobacteria（酸杆菌门，包括其他细菌，图1a）的相对丰度有显著差异（前者p = 0.007，后者p = 0.028）。仅在结构（DNA）群落中观察到这种差异。接种V. dahliae后，真菌群落无显著变化。接种V. dahliae后，Frantoio根际细菌群落中有两个小门（DNA中的Latecibacteria和RNA中的Candidate division WPS-1）受到影响（数据未显示）。相比之下，Picual根际（结构（DNA）群落） 中6个门显著改变，接种病原菌后，除Proteobacteria（变形菌）外，其他门均减少（附件2：图S1）。关于真菌群落，接种V. dahliae后，Frantoio根际结构（DNA）真菌群落无显著变化，但次要门Mucoromycota有所减少（数据未显示）。与此相反，当接种V. dahliae后，Picual的主要门Glomeromycota（球囊菌门）在结构（DNA）和功能（RNA）群落中均有所下降（(p < 0.03）（图2c, d）。确实，在Glomeromycota（球囊菌门）中序列（丛枝菌根真菌，AMF）中84.6％被归类为科水平，它们都属于Glomeraceae（球囊菌科）。有趣的是，在比较该门的根内/根际比率时，与未接种植株计算出的比率（结构群落2.33和功能群落0.98）相比，接种V. dahliae后Picual的根内/根际比急剧上升（结构群落6.33和功能群落2.73）。相比之下，在Frantoio样品中，该比率的增加明显更温和（结构群落从对照组的1.70增加到接种病原菌组的3.01，功能群落从对照组的1.18增加到接种病原菌组的1.54）（图1c, d和2c, d）。【橄榄地下群落在属水平上的细微变化】超过63%的细菌序列被归类为属水平（对根内而言> 74%），180~188个不同的属（附件3：表S2）。最终，83个根内属和143个根际属被认为是Picual / Frantoio核心细菌组的一部分，其占分类序列的98％以上。未接种和接种了V. dahliae的植物的核心细菌组共享100%的属（附件4：表S3）。在未接种的植物中，两个品种的根内结构（DNA）和功能（RNA）群落分别在20个属和32个属的相对丰度（4个时间点T0、T8、T15和T30的平均值，）上有显著差异（(p < 0.05）。值得注意的是，在两个群落（结构和功能）中，Picual中的Cellvibrio（纤维弧菌属）丰度较高，Frantoio中的Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌属）、Pseudonocardia（假诺卡氏菌属）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌属）、Legionella（军团菌属）和 Rhodanobacter（罗河杆菌属）丰度较高。其余属仅在这些群落（如：Saccharothrix（糖丝菌属）、Mycobacterium（分支杆菌属）、Streptomyces（链霉菌属）和Flavobacterium（黄杆菌属））中的一个属中有显著差异，或相对丰度较低（小于0.2%；附件5：图S2a, b）。与未接种植物相比，接种V. dahliae后，Frantoio根内结构(DNA)群落中丰度非常低的Streptomyces（链霉菌属）和其他16个属丰度降低（附件6：图S3a）。相比之下，接种病原菌后，该品种的Steroidobacter和Ohtaekwnagia增加。在Picual植物中，接种后Gp10和Rhodanobacter（罗河杆菌属）下降，而Cellvibrio（纤维弧菌属）增加（附件6：图S3b）。根际变化少于根内对照（即：Picual和Frantoio植物在结构群落中有5个属，在功能群落中有9个属）（附件7：图S4）。在根际，接种病原菌只影响了Frantoio植物中的少数次要属（相对丰度＜0.2%）。此外，这些属在结构和功能群落之间是不同的（附件8：图S5a，b）。除了主要属Gp4外，在Picual植物中观察到了类似的模式，接种V. dahliae后结构群落降低（附件8：图S5c，d）。关于真菌群落，33% ~ 50%的序列被归类为属水平（105~129个不同的属；附件9：表S4）。只有17个（根际）属和37个（根内）属被认为是Picual和Frantoio核心菌群中共有的部分，占分类序列的79%以上。至于核心菌群，100%的核心真菌属在未接种和接种V. dahliae的植物中共有，但现在已成为接种植物根际核心菌群的主要属之一的Verticillium属除外（附件10：表S5）。在根内，比较两个橄榄品种的未接种植物时，只有8个（结构群落）和6个（功能群落）属显着不同（附件11：图S6a，b）。Picual对照植物的结构（DNA）和功能（RNA）群落中Macrophomina（壳球孢属）和Fusarium（镰刀菌属）丰度较高，而Frantoio中Acremonium（枝顶孢属） 和Lepidosphaeria丰度较高。此外，在Picual结构群落中，Lophiostoma和 Rhizoctonia（丝核菌属）丰度较高，而Frantoio中Ilyonectrya丰度较高。有趣的是，在任何取样时间点均未在接种病原菌植物的根内发现Verticillium（轮枝菌属）。综上，接种V. dahliae后没有观察到该微生境的变化。在根际，在结构群落和功能群落中，Frantoio的Acremonium（枝顶孢属）、Lepidosphaeria和Ilyonectria再次出现，伴随着Chaetomium（毛壳菌属）和Cirrenalia（海卷孢属），丰度显著高于未接种的Picual（p < 0.05）。相比之下，Picual中只有Lecanicillium、Plectosphaerella和Setophaeosphaeria的相对丰度显著高于Frantoio（附件12：图S7a b）。在接种病原菌后，伴随着Verticillium的入侵，Frantoio植物根际中Gemoyces属增加，而Dominikia属和Ilyonectria属减少（附件13：图S8a）。最后，在接种病原菌的Picual植株根际，除了出现Verticillium外，Preussia属和Chaetomium属也增加了；而在未接种植物中，Fusarium、Glomus、Septoglomus和Dominikia减少（附件13：图S8b）。

接种Verticillium dahliae后，微生物群落网络拓扑结构发生的重大变化

Uncovering alterations in the belowground microbiota ofolive cultivars upon inoculation with Verticillium dahliae Dpathotype共现网络分析表明，每个微生境（根内和根际）中群落成员间的相互作用差异很大。在结构（DNA）和功能（RNA）群落之间也存在差异。有趣的是，即使每个微生境的结构和功能群落相似（见上文），在接种病原菌后品种之间也发现了显著不同的网络（p < 0.0005）（表3）。例如，在接种V. dahliae后，Frantoio根内结构群落转为高度连接（见avgK、GD和avgCC参数）、低模块化（见Modularity参数）的网络（表3）。尽管程度较小，功能群落也呈现出相同的趋势（表3）。相反，Picual植物在根内显示出截然不同的网络拓扑结构（即接种病原体后，较低的连通性和较高的模块化程度），功能群落表现出更明显的变化。然而，在两个品种的根际，在有病原体存在的地方(见上文)，群落在结构(DNA)和功能(RNA)水平上都表现出相似的网络拓扑结构变化：节点间连接性降低，节点间距离增加，区域化(模块化)程度增加。结构和功能群落之间的唯一区别是后者的测地距离（GD）减小（表3）。值得一提的是，在所有情况下，V. dahliae的接种增加了负相互作用的数量，如正边缘百分比（PEP）的降低表明对根内功能群落影响更加明显（表3）。在根内方面，接种V. dahliae后，两个品种的关键OTU均发生了变化。最显著的变化是接种V. dahliae后植物结构群落中缺乏Glomeromycota（球囊菌门），伴随着功能群落中一些Ascomycota（子囊菌门）的出现（附件14：图S9；附件15：图S10）。有趣的是，在没有病原体侵入的情况下，在这种微生境网络中缺乏Glomeromycota（球囊菌门）并出现Ascomycota（子囊菌门）OTUs。由于接种了V. dahliae，Frantoio植物的结构和功能群落网络出现了最明显的变化（图3；附件16：图S11）。未接种的对照植物的结构群落中的关键OUT，分类为Glomus、Rhizophagus (Glomeromycota)、Phenylobacterium、Xanthomonas、Ferrovibrio、Sphingomonas、Gammaproteobacteria (Proteobacteria)、Microbaceteriaceae (Actinobacteria)和Roseimicrobium (Verrucomicrobia)。然而，在接种病原菌后，前者被Steroidobacter、Rhizobium、Pseudomonas、Brevundimonas、Ancylobacter、Legionella、Hylemonella (Proteobacteria)、Streptomyces、Actinomycetales (Actinobacteria)、Opitutus、Prosthecobacter (Verrucomicrobia)、Dyadobacter、Chitinophagaceae (Bacteroidetes) 和两种未分类菌所取代。在两种情况下，只有Devosia和Hydrogenophaga（Proteobacteria）存在，尽管Devosia从3个代表性OUT减到1个（附件14：图S9）。未接种的Picual结构群落的主要OTU是Rhizophagus (Glomeromycota)和Roseimicrobium (Verrucomicrobia)，像Frantoio 中的Rhizophagus (Glomeromycota)、Stenotrophomonas、Devosia、Steroidobacter、Luteimonas、(Proteobacteria)、Actinoplanes (Actinobacteria)和Bacillus (Firmicutes) 一样。与与Frantoio菌群相似，接种后，所有的主要OTU均被Flavobacterium (Bacteroidetes) 和Sphingomonas、Rhodanobacter、Peredibacter、Devosia和四个未分类属所取代，它们都属于Proteobacteria（变形菌门）（附件15：图S10）。在根际，共现网络分析表明，接种V. dahliae后，Picual植物的结构群落发生了最明显的变化，GD和模块性的急剧增加清楚地证明了这一点（表3）。无论是在结构（DNA）还是功能（RNA）水平，这两个品种之间最明显的变化是在Picual网络中出现了Verticillium。相反，在Frantoio网络中未观察到此变化（图4；附件17：图S12）。

讨论

本研究的目的是揭示与两个对VWO敏感性不同的橄榄品种相关的根际和根内微生物群落的结构、功能和相互作用，并确定V. dahliae的引入如何改变它们。我们的研究的第一个相关结果是，无论是植物基因型还是接种V. dahliae，都不会显着影响两个橄榄品种的根际和根内微生物群落，如α和β多样性的分析所揭示的那样。在T0和其他采样时间点（T8，T15和T30 dai）观察到的唯一恒定的变化是，加150mL水（对照，未接种组）或150mL V. dahliae分生孢子悬浮液（接种组）会对原生微生物群落有明显影响。

群落分类单元相对丰度变化最显著。通过比较不同品种未接种植株的微生物群落，发现一些有趣的差异值得探讨。在门水平上，无论是根际还是根内，无论是结构(DNA)还是功能(RNA)群落，Picual中Candidatus Saccharibacteria的相对丰度都较高，而Frantoio 中Proteobacteria的相对丰度更高。Candidatus Saccharibacteria，以前被称为Candidate Division TM7，最近被认为是抑制细菌性枯萎病的关键生物标记，可指示植物的病态和胁迫态[34]。本研究表明，烟草植株中Candidatus Saccharibacteria和R. solanacearum的相对丰度呈负相关。与该发现一致，我们发现接种V. dahliae后，Picual植物的根际结构群落中的Candidatus Saccharibacteria减少（图2a），这可能是该品种经历生物胁迫后的结果。相反，在Frantoio群落中没有发现这个门的任何变化。推测该门可能是Picual遭受病原菌胁迫后的指示，这种胁迫可能与该品种易感VWO有关。我们想强调的是，在根际微生物群落中，更重要的是，与在Picual中观察到的情况相比，在未接种的Frantoio植物根际微生物群落中，相对丰度较高的属被认为是植物促生微生物（PGPM）。一方面，在耐VWO品种的根际细菌群落中，必须强调这些属：Acidovorax（据报道能促进大麦生长[35]）、Neorhizobium（与辣椒生物量刺激有关[36]）、Nocardia、Ancylobacter（产植物激素吲哚-3-乙酸(IAA) [37，38]）和Lentzea（与小麦生长刺激有关[39]）。关于真菌，Acremonium属值得一提，因为它参与植物生长[40]。另一方面，在Frantoio根内，下列细菌属丰度明显较高：Neorhizobium、Bradyrhizobium（能够在豆类中形成固氮结节，并在萝卜、番茄和水稻中形成结节状结构[41]）、Sphingomonas（据报道可增加中药植物生物量[42]）、Actinoplanes（参与促进黄瓜生长[39]）和Caulobacter（被报道可产薰衣草的植物激素[43]）。关于真菌和根际报道，还发现了Trichoderma（著名的PGPM和BCA）和Acremonium属（如[44]）。王等[24]认为健康土壤中的有益微生物可以促进植物生长，并控制土传疾病，与之一致，我们发现与Picual观察到的情况相比，Frantoio微生物群落中PGPM丰度较高可能与其耐VWO有关。相反，Picual根内群落中真菌（如Fusarium、Macrophomina和Rhizoctonia）相对丰度更高，这些属以包含植物病原菌而闻名 [45-47]。我们推测，这些属中有害代表的存在可能以某种方式增加了Picual根对V. dahliae攻击的敏感性。与此相关，Khoury和Alcorn[47]报道了两个根系损伤的棉花品种被Rhizoctonia solani感染，这可能会阻碍植物通过物理屏障阻止V. albo-atrum定植。Picual和Frantoio的细菌根内生菌群落在某些类群相对丰度上显示出显著变化，这可能是由于接种了V. dahliae所致。例如，Picual根内显示出Acidobacteria（酸杆菌门）的减少。这与该门的存在与植物健康有关，并且该门的减少与R. solanacearum感染的烟草的病态有关[48] 的研究结果一致。同样的情况很可能发生在VWO易感的橄榄品种上，而在Frantoio植物中却没有。相反，在Frantoio的根内群落中观察到Actinobacteria（放线菌）减少（但在Picual中未观察到），与此形成对照的是，有研究报道该门使番茄对V. dahliae抗性增强 [49]。

我们研究的另一有趣结果是，检测到根际（病原体首先与植物直接接触的微生境）群落的变化。其中，Frantoio植物的结构和功能微生物群落仅在其相关的细菌区系和真菌区系的次要门中有显著变化，说明V. dahliae的引入对VWO耐受品种的影响较小。相反，接种V. dahliae后Picual根际群落发生了重大变化。事实上，由于V. dahliae的存在，VWO易感品种中6个门出现了显著变化，最有趣的是Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）的减少。值得一提的是，在其他研究中也有根际Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）相对丰度与V. dahliae感染呈负相关的报道[50]。Inderbitzin等人[51]也发现了V. dahliae感染后Proteobacteria（变形菌门）增加，这与我们的结果一致。Proteobacteria（变形菌门）对植物健康的活性和积极作用已得到充分证明[19]。真菌方面，接种病原菌后，Picual根际Glomeromycota（球囊菌门）的相对丰度显著降低。该门的属被归类为AMF，众所周知，AMF通过几种作用方式对宿主植物的健康状况起作用，包括激活对土传病原菌(如：Phytophthora（疫霉菌）、Fusarium（镰刀菌）、Verticillium（黄萎病菌）)的防御机制。AMF的有益作用已在其他地方进行了全面综述[52]。此外，根内/根际Glomeromycota（球囊菌门）的相对丰度的高比率与杂草对策（其特征是能快速地定居在无竞争者的环境中）中AMF的生物量比率一致，其特征在于能在没有竞争者的生境中快速定植，这些生境由于最近的干扰而没有竞争者。由于在我们的温室试验条件下，既没有限制条件（例如养分），也没有胁迫条件（如温度、水），所以在未接种植物（和两个品种）中发现的根内/根际比率与AMF群落建立的早期阶段一致[53]。但是，在接种V. dahliae后，Picual根际这一比率增加，Glomeromycota（球囊菌门）显著减少，可能是由于AMF的保护作用。这与Newsham等人[54]的观点一致，他们认为AMF的活动主要集中在根内，对病原菌起防御作用，而不是作为营养动员剂。此外，观察到AMF根内/根际比率的改变可能表明Picical植物在接种病原菌后处于胁迫状态，部分解释了该品种对VWO的高易感性。

我们想强调的是，在比较未接种和接种V. dahliae的植物时，没有一个橄榄品种在分类单元上存在/缺乏显著差异。此外，在结构和功能水平上也没有差异。的确，在未接种的两个品种的植株上，细菌组和真菌组核心几乎完全相同，在后者和接种病原菌的植物中发现了类似情况。这说明了一个事实，Frantoio和Picual似乎在招募并庇护相似的地下微生物群落，而接种V. dahliae并没有引起这些群落多样性的显著变化，至少在我们的实验条件下是这样。分类单元共现模式的网络分析为复杂微生物群落的结构提供了新见解，否则很难用微生物生态学中广泛使用的标准α/β多样性指标[30]来揭示。已有研究表明，复杂的土壤微生物群落网络（具有高节点数、连接数和平均连接度的网络），而不是简单的某一微生物，对植物有益[28]。确实，复杂的网络有利于更好地应对环境变化或抑制土传病害。例如，与网络中连接度较低的群落相比，具有复杂网络的烟草根际微生物群落发生细菌性枯萎病的几率较低[29]。同样，在甘蓝型油菜种子的微生物群落中，观察到紧密结合和复杂的微生物网络，并被认为是新来者(无论是有益的还是致病的)难以入侵这些生态位的特征。我们的发现与这些研究一致。事实上，与Picual相比，接种V. dahliae后，Frantoio根内群落在共现网络中复杂性显著增加(表3和图3)。共现相互作用的研究主要集中在根际和叶际微生境[29，30]。据我们所知，这是我们首次采用这种方法来评估根内群落，以及在引入土传病原菌后该微生境中发生的拓扑变化。

接种V. dahliae后，两个品种的根际微生物群落的复杂性均有所下降。这种变化在Picual中更为显著，特别是在结构群落中。此外，在两个品种中还观察到根际微生物网络的模块性同时增加。Delmas等人[56]提出了通过增加模块化和GD来维持群落稳定，从而保护群落免受病原菌的干扰。的确，Cardinale等[32]的研究表明，与生菜根部松散的细菌网络相关的土传病原菌的生物防治有所增加。因此，通过减少受影响模块和相邻模块之间的相互作用（共现或共排斥），可以减轻V. dahliae的负面影响[55]。原则上，这两个品种的根际微生物群落遵循相同的策略，这一策略在Picual植物中注定失败，因为病原菌与最大模块OTUs的相互作用强烈（图4；附件16：图S11）。这种相互作用可以解释在Picual根际结构群落中观察到GD的增长比在Frantoio中更高。然而，由于目前可用技术的局限性[57]，不能完全排除病原菌可能也与Frantoio植物的根际微生物群落发生了相互作用，这种情况在Picual中可以清楚地观察到。最后，我们的结果还表明，与耐性品种（Frantoio）相比，在VWO敏感品种（Picual）中引入V. dahliae会增加负面相互作用（如竞争和拮抗）的数量。

结论

橄榄品种对V. dahliae的差异敏感性主要归因于宿主根部的基础病原菌和早期病原体菌诱导的差异转录反应[10]，以及与不同品种根部相互作用时病原菌的定性和定量差异转录反应[ 58]。在本研究中，还建立了VWO耐受水平与橄榄地下常驻微生物群落之间的联系。一方面，我们的研究结果强调有必要在整体概念框架内研究对生物胁迫的耐受性，以期在林木作物农业中获得更全面的视角[59]。另一方面，研究结果也为VWO抗性的生物防治和育种等研究领域开辟了新思路。关于生物防治策略问题，VWO耐受品种相关群落中有益属的丰度较高，这一事实值得关注，可用于识别新型潜在BCA和/或PGPR。此外，还必须评估显著抗VWO的BCA[12-14] 的引入对地下群落的结构、功能和网络交互的影响。这与出现大量潜在有害组分的群落有关，如在VWO易感Picual中所报道的一样。这些信息也可能与橄榄育种计划有关，该计划旨在培育VWO抗性/耐性的改良新品种，其中必须考虑地下常驻微生物群的作用。此外，由于橄榄树在苗圃的繁殖主要和传统上是通过茎扦插生根来进行的，因此了解在根系生长过程中招募并建立的根相关微生物区系的微生物成分似乎是最重要的。虽然接种V. dahliae后对橄榄地下微生物群落的结构(DNA)和功能(RNA)没有显著改变，但微生物共现相互作用在接种V. dahliae后出现显著变化（综述的简化方案如图5所示）。本工作首次揭示了根内微生物网络拓扑结构的变化与不同品种对相关土传病原菌的耐受水平之间的相关性。仅在VWO易感品种群落的共现网络中检测到V. dahliae，表明病原菌被引入后在群落中起着中心作用，而Frantoio则成功地将其限制在最相关的模块之外。对微生物群落共生相互作用的深入研究表明，共现网络是揭示微生物区系对生物胁迫是耐受还是易感的有力工具，我们鼓励在其他树木病理系统中进行研究。

材料方法

【样本收集】

两个品种（Picual和Frantoio，分别为VWO易感型和耐受型[10]）的橄榄树（3个月大）来自Córdoba省的一个商业苗圃，用于温室试验。从苗圃接收后，将橄榄树种在盆中（11×11×12 cm，每盆一株），每盆中含无菌土（70%，w/w）、沙子（7.5%）和商业苗圃盆栽基质（7.5％），其中土壤收集自Córdoba市的世界橄榄种质收藏库。在接种病原菌前，将橄榄树在温室（自然光照，昼夜温度27/21℃）中培养（驯化）3个月，使适应新环境。驯化期结束后，每盆接种150 mL V. dahlia V-9371（D病型代表菌株）分生孢子悬浮液（1×106分生孢子/mL）[60]。对照组（不接种V. dahlia）浇150 mL水。接种V. dahlia后，在0天（每个品种4株对照）、8天、15天、30天（每个品种每个时间点4株）取样收集每棵橄榄的根组织及根际土壤。采集根际土壤2g，-80℃保存于LifeGuardTM土壤保存液(MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad, CA, USA)中，直至使用。采集根，用20 mL 0.8%的NaCl涡流清洗，去除附着土壤。之后用蒸馏水清洗5次。表面消毒：70%酒精5min，次氯酸钠(3.7%)，0.01%吐温20 3min，最后在无菌蒸馏水中冲洗3次。然后，立即将根组织冷冻在液氮中，并储存在−80℃直到使用。为了确认消毒的效果，将最后漂洗使用的无菌水接种于NA(营养琼脂)和LB平板上，在28℃下培养7天。然后，检查培养皿中是否被微生物污染。

【DNA和RNA提取和Illumina测序】

在收到样品的24h内，遵照说明书，用RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit和RNA PowerSoil DNA Elution accessory kit(MoBio, Laboratories Inc., CA, USA)提取土壤样本中的RNA和DNA。用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取根中的RNA，然后根据说明书，用DNase I（Qiagen）去除污染的基因组DNA，随后用RNeasy MinElute cleanup Kit (Qiagen)进行纯化。根据说明书，用Nucleon® Phytopure植物DNA提取试剂盒(GE Healthcare UK Ltd, hamshire, UK) 提取纯基因组DNA。按照Lasa等人[61]的方法获得cDNA。cDNA和DNA的产量和质量均通过在0.8% (w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳来检测，该凝胶用GelRed染色并在UV灯下可视，使用Qubit 3.0荧光仪(Life Technologies, Grand Island, NY)检测。在西班牙格拉纳达的寄生虫和生物医学研究所“Lóp ezNeyra”（CSIC）的基因组学服务处，用Illumina MiSeq平台对cDNA和DNA进行了测序。在第一轮中，根据Takahashi等人的研究[62]，使用引物对Pro341F（5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′）和Pro805R（5′-GACTACNVGGGTATCTA ATCC-3′），通过扩增cDNA和DNA中16S rRNA基因的高变区V3-V4，构建原核库。这些扩增子被标记到PNA PCR夹上，以减少质体和线粒体DNA扩增[63]。在第二轮中，使用引物对ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[64]和fITS7（5’-GTGARTCATCGAAT CTTTG-3’）[65] ，通过扩增cDNA和DNA的 ITS2区域，构建真核库。两轮均使用配对末端2 x 300 bp (PE 300)策略进行测序。

【数据质量筛选和重叠】

基于特定的条形码对样品进行信号分离，用FastQC v.0.11.5[66]对Phi-X174-free reads进行质量检查，用FASTX-Toolkit v.0.014[67]进行末端裁剪。丢弃所有低质量序列，直到达到高于Q20的质量值。将paired reads与fastq-join v.1.3.1[68]进行重叠，要求重叠区域的最小重叠值40 bp，最大差异为15%。这两个库均使用相同的生物信息学工具进行处理，但操作途径不同，详情如下。

【原核生物的数据处理】

用SEED2 v.2.1.05[69]和MOTHUR v.1.40.5[70]软件对原核序列进行修剪和聚类。使用SEED2丢弃特异性引物，消除所有歧义、长度小于384 bp或平均阅读质量低于Q30的序列。之后，用MOTHUR，用SILVA gold reference fasta去除嵌合读段，并将高质量序列以97％的簇集到OTU中。最后，根据Bokulich等[71]人的方法，去除了少于总序列0.005％的OTU。此外，在剩余的OTU中，将每个样本中少于总序列0.005%的OUT修正为0，根据所使用的MOCK群落(ZymoBIOMICS Microbial Community Standard II (Log Distribution), ZYMO RESEARCH, CA, USA)。OTU用80％的引导程序分类到核糖体数据库计划（RDP-II）16S rRNA参考数据库，训练集v.16 MOTHUR-formatted中[72]。从数据集中删除了识别为线粒体，叶绿体和未知序列（在kingdom level未分类）的序列。

【真核生物的数据处理】

在SEED2中，通过去除模糊的和平均读取质量低于Q30的序列，对真核库进行质量修饰。去除特异性引物和小于290 bp的那些序列。随后，用MOTHUR中的工具VSEARCH “De Novo”，对嵌合序列进行识别和丢弃，对高质量序列进行基于距离的贪婪聚类，其相似度为97%。根据网站建议的参数并使用Findley等人[74]的方法，使用UNITE v.7.2动态数据库[73]对最丰富的OTU序列进行了分类。在OTU表中应用了与原核数据相同的OTU修整。最后，仅保留了属于真菌界的OUT，以供进一步分析。

【核心微生物建设】

构建DNA和RNA核心细菌组和真菌组时，只考虑了每个处理中至少90%重复出现的属[75]。共有核心属存在于两个品种中；特定核心属存在于一个品种中，但在另一品种10%以上的重复中缺失。构建完成后，将核心微生物群落绘制在维恩图中。

【统计分析】

所有分析均使用Fernández-González等人先前描述的脚本进行[18]。简单来说，将α多样性指数（Observed和Chao1丰富度；Shannon和InvSimpson）与KruskalWallis检验进行了比较，并使用R包agricolae 用Benjamini-Hochberg法通过FDR校正p值。对于β多样性，使用BioConductor软件包edgeR，用“trimmed means of M” (TMM)方法，对过滤后的OTU序列计数进行归一化处理。通过含9999个置换的vegan包中adonis函数和betadisper函数的PERMANOVA（置换多元方差分析）和BETADISPER方法进行归一化。在适用的情况下，使用软件包pairwiseAdonis中的pairwise adonis函数来评估组间的成对差异。为了可视化研究群落间异同（相似或差异），通过NMDS（非度量多维尺度分析）和PCoA（主坐标分析）绘制出在PERMANOVA分析中有差异的结果。用Bray-Curtis差异在两个维度上对ordinate（排序）各处理间的β多样性方差。使用R软件包phyloseq进行排序分析。对于每个显著的PERMANOVA比较，选择NMDS还是PCoA取决于哪一个最能代表置换分析的结果。通过STAMP v.2.1.3软件，使用非标准化计数中的比例测试不同分类单元的丰度，获得生物学相关的原核和真菌门、目和种，多组比较用ANOVA Games-Howell’s post hoc检验，两组比较用Welch’s t检验，使用Benjamini-Hochberg FDR对多次检验进行校正。筛选出上述两种方法中具有统计学显著差异的分类单元，仅保留那些比例差异≥0.5％或比例≥2的分类单元，认为其具有生物学相关性，并进行最终选择。

【网络构建、比较和可视化】

首先，为每个品种（Picual和Frantoio）、每个区室（根内和根际）、每个核酸（DNA和RNA）和每种处理（对照和接种V. dahlia）分别构建细菌和真菌网络。在每个网络中，除Frantoio DNA对照组（n=15）中的Fra_3_0_P和Picual DNA和RNA接种组（n=11）中的Pic_1_30_S外，所有时间点和重复数（对照组n=16，接种组n=12）被认为是不同OUT之间更准确的相互关系。然后，为构建这16个网络，按照开发者的建议使用MENAP网站(http://ieg4.rccc.ou.edu/mena/main.cgi) [28,31,76-78]。从默认选项更改的唯一参数是分离方法。的确，根据Jiemeng等人[28]的推荐，选择用模拟退火法代替贪婪模块化优化。此外，为利用品种间经验网络的Student t检验比较的全局属性的标准偏差，对每个经验网络执行了100个随机网络。所有网络均采用Cytoscape v.3.7.1绘制[78]。最后，在Excel (ZiPi图)中绘制关键的OTU，并比较两个处理在品种、区室和核酸间的差异。

图表

图1 橄榄品种根内群落在门水平上的分类学特征。a、c结构(DNA)群落；b、d功能(RNA)群落

图2 橄榄品种根际群落在门水平上的分类学特征。a、c结构(DNA)群落；b、d功能(RNA)群落

表3 Frantoio和Picual共现网络的主要拓扑性质

图3 Frantoio和Picual（对照和接种Verticillium dahliae）根内结构群落的共现网络。数字对应按大小排序的模块数量

图4 Frantoio和Picual（对照和接种Verticillium dahliae）根际结构群落的共现网络。数字对应按大小排序的模块数量

图5 橄榄树品种的主要研究成果（地下微生物群落的比较和Verticillium dahliae接种在微生物网络中的作用）示意图。在网络中，红色的边表示模块间的负相互作用(实心圆)。红色圆圈表示包含V. dahliae的模块。在底部表格中，品种比较部分（左）显示了未接种时Frantoio或Picual群落中相对丰度显著较高的细菌和真菌属。接种V. dahliae影响效果（右）显示了接种病原菌后最显著的变化，在分类学（每个微生境下微生物分类单元的相对丰度，箭头：减少（红色）；增加（绿色））和网络（每个微生境下OTUs，箭头：消失（红色）；出现（绿色））水平上。

补充信息

附件1：表S1 研究样本的编码和描述，细菌和真菌群落也用同样的编码附件2：图S1 接种Verticillium dahliae后，Picual根际细菌结构(DNA)群落在门水平上的显著变化。No/green: 未接种; Yes/red：接种Verticillium dahliae。附件3：表S2 在未接种条件下培养的“Frantoio”（黄色）和“Picual”（绿色）的核心细菌群。浅棕色为共享的核心菌群。红色的属为RNA(功能群落)核心。黑体字表示相对丰度为> 1%的主要属(两个品种之和)。附件4：表S3 在接种Verticillium dahliae条件下培养的“Frantoio”（黄色）和“Picual”（绿色）的核心细菌群。浅棕色为共享的核心菌群。红色的属为RNA(功能群落)核心。黑体字表示相对丰度为> 1%的主要属(两个品种之和)。附件5：图S2 未接种的“Frantoio”（绿色）和“Picual”（蓝色）植物之间有显著差异的属。图中显示了根内结构（a）和功能（b）细菌群落。附件6：图S3 接种Verticillium dahliae后，“Frantoio”（a）和“Picual”（b）根内细菌结构（DNA）群落中显著变化的属。No/green: 未接种; Yes/red：接种Verticillium dahliae。附件7；图S4 未接种的“Frantoio”（绿色）和“Picual”（蓝色）植物之间有显著差异的属。图中显示了根际结构（a）和功能（b）细菌群落。附件8：图S5 接种Verticillium dahliae后，Frantoio和Picual根际细菌结构和功能群落中呈显著变化的属。No/green: 未接种; Yes/red：接种Verticillium dahliae。附件9：表S4 在未接种条件下培养的“Frantoio”（黄色）和“Picual”（绿色）的核心真菌群。浅棕色为共享的核心菌群。红色的属为RNA(功能群落)核心。黑体字表示相对丰度为> 1%的主要属(两个品种之和)。附件10：表S5 在接种Verticillium dahliae条件下培养的“Frantoio”（黄色）和“Picual”（绿色）的核心真菌群。浅棕色为共享的核心菌群。红色的属为RNA(功能群落)核心。黑体字表示相对丰度为> 1%的主要属(两个品种之和)。附件11：图S6 未接种的“Frantoio”（ 波尔多）和“Picual”（ 紫罗兰）植物之间有显著差异的属。图中显示了根内结构（a）和功能（b）真菌群落。附件12：图S7 未接种的“Frantoio”（ 波尔多）和“Picual”（ 紫罗兰）植物之间有显著差异的属。图中显示了根际结构（a）和功能（b）真菌群落。附件13：图S8 接种Verticillium dahliae后，Frantoio和Picual根际真菌结构和功能群落中呈显著变化的属。No/green: 未接种; Yes/red：接种Verticillium dahliae。附件14；图S9 ZiPi图突出了接种Verticillium dahliae后Frantoio根内微生物结构（a）和功能（b）群落的关键OTUs。表中是每个关键OTU的详细资料。附件15：图S10 ZiPi图突出了接种Verticillium dahliae后Picual根内微生物结构（a）和功能（b）群落的关键OTUs。表中是每个关键OTU的详细资料。附件16：图S11 接种前后，两个品种根内功能（RNA）群落的共现网络附件17：图S12 接种前后，两个品种根际功能（RNA）群落的共现网络。