自20世纪80年代开始，治疗性蛋白药物（包括蛋白、酶、抗体、抗体-药物偶联物等）在多种重大疾病（如肿瘤）的治疗领域中发挥巨大作用，极大地推动了人类健康事业的发展。但是该类型药物自身的免疫原性（Immunogenicity）引发的安全和疗效问题也成为其发展进程中的绊脚石，如诺和诺德长效重组Factor VIIa于临床III期被叫停，以及辉瑞PCSK9抑制剂在临床III期因免疫原性过强而被迫停止上市计划，免疫原性带来的问题多次成为治疗性蛋白药物研发进程中的拦路虎。免疫原性通常是指治疗性蛋白和/或其代谢物诱发对自身或相关蛋白的免疫应答或免疫相关事件的能力。当治疗类蛋白产品作为某些疾病的治疗药物时，会被机体识别为外来物质（抗原）而产生免疫应答，但对于治疗性蛋白的不必要或非预期的免疫应答则会给药物的安全和疗效带来风险。我们在之前文章《生物分析专栏 | 治疗性蛋白药物免疫原性分析》中介绍过免疫原性形成的机制，在此不再赘述。
图1 治疗性蛋白药物的免疫原性产生过程[1]
不必要或非预期的免疫应答一方面可导致机体产生抗药抗体（Anti-drug antibodies，ADA），包括抗药抗体、中和抗体、免疫复合物、抗独特型抗体等[2]，ADA可中和药物的生物学活性，影响药代动力学参数、甚至可导致药物疗效降低或缺失。特别是当这种不必要或非预期的免疫应答与内源性蛋白产生交叉免疫反应，可能带来严重的临床安全问题。典型的案例是重组人促红素（EPO）。自1986年以来，数百万人长期使用重组人促红素治疗慢性肾功能衰竭贫血，鲜有不良反应的报道[3-4]，但这一情况在1998年发生了“逆转”，从1998年至2002年5月，多个地区受试者因使用EPO导致获得性纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA），患者数量高达108例，其中大多数病例的血中可检测到中和性抗促红素抗体。
图2 ADA对药物安全和疗效方面的影响[5]
由T/B细胞介导的抗药抗体一般需要一段时间才能产生，从几周到几个月，有些可能需要几年长期用药后才会出现。而直接针对免疫细胞的免疫调节类药物可能直接激活免疫细胞的反应，导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）。CRS概念在1990年被首次被提出[6]，是指由于大量细胞因子（包括干扰素、白介素、趋化因子、肿瘤坏死因子等）释放所引起的一种级联放大的系统性免疫应答[7-9]。2006年，CD28的超级激动剂TGN1412在I期临床试验中诱发了CRS，造成了灾难性后果，6 名健康志愿者均发生了严重的系统性炎症反应，健康受试者在短暂时间内变成“大象人”。由于免疫调解类药物可以直接激活免疫细胞，短时间内产生大量免疫因子，一般反应较快，临床后果严重，尤其需要关注，NMPA在新发布的指导原则中单独提及了相关评价内容。
图3 TGN1412引发CRS导致的严重临床安全事件[10]
免疫原性除了对受试者急性或长期的安全性影响，还可影响药物的药代动力学(PK)、药效学(PD)、生物利用度和疗效性。正是基于此，FDA在2019年发布的免疫原性评估指导原则《Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection Guidance for Industry 》中则直接将“免疫原性”定义为治疗性蛋白产品对自身和相关蛋白产生免疫应答或诱发免疫相关临床不良事件的倾向[11]。免疫原性影响贯穿药物研发的整个生命周期，从物质筛选直至上市批准后都应该对免疫原性以及带来的临床影响进行监测。
图4 免疫原性的生命周期
虽然免疫原性评估对于治疗性蛋白药物研发和申报必不可少，但对免疫原性评估的指导原则一度相当有限。1997年，ICH首次发布了生物技术药物的非临床安全性评价指南 ，首次将免疫原性评估纳入技术法规中，旨在提高各种生物技术药物非临床安全性研究结果的质量及一致性，以促进生物制药行业的发展 。欧洲药品监管机构（EMA）的人用药品委员会 (CHMP)于2007年发布免疫原性评估的指导原则[12]，旨在协助申办方评估其研发的药物对免疫系统的影响 。该指导原则涵盖了蛋白质、多肽及其衍生物 ，同时还包括了佐剂在内的各种产品组分。由于EMA当时对免疫原性数据的评估缺少实际经验，故当时该指导原则主要提出了“需要知道”的问题，并没有详细说明如何生成这些免疫原性数据。直至2017年，EMA发布该指导原则的最终版本（Final Version）[13]，但其仍未对技术细节进行过多规定，秉承着适用目的原则（fit to purpose, FTP），要求申办方选择最优的方法来响应或满足监管要求。对于该指导原则中没有涉及到的问题，或者当药物开发人员无法满足本指导原则的要求时，可以向EMA寻求科学建议。EMA的这一做法既为监管指导设定了框架，提出建立在科学基础上的要求，同时也适应了国家和地区政治和经济发展的需要[14]。美国FDA于2014年首次发布了免疫原性评估指导原则[15]，其中给出免疫原性的影响因素和评价策略。2016年，为了适应行业的发展以及审评要求，又发布了针对ADA检测方法开发和验证的指导原则草案并于2019年正式生效[11]。与EMA发布的指导原则相比，FDA于2019年发布的ADA方法开发和验证的指导原则在细节上更加详细，特别是在ADA检测的技术细节上。此外，FDA还定期通过行业会议的召开、发布白皮书等方式给予申办方更多的指导。与EMA一样，该指导原则也秉承着FTP原则，申办方或者药物开发人员在药物研发过程中也可以向FDA寻求建议。国家药品监督管理局（NMPA）于2020年08月24日发布了《药物免疫原性研究技术指导原则（征求意见稿）》[16]，并于2021年03月29日发布正式版本[17]，总体的评估策略与FDA相同，不同于已有的FDA和EMA指导原则，NMPA正式版充分考虑到了非临床和临床免疫原性研究的方法的差别。该指导原则的出台填补了我国免疫原性研究相关技术规范的空白，彰显了监管部门鼓励和引导生物药物开发人员进一步提高免疫原性相关研究规范性的愿望。根据治疗性蛋白免疫原性产生的机制，不必要或非预期的免疫应答或免疫原性可导致抗药抗体的形成以及细胞因子的释放，从而影响药物的安全和疗效，故免疫原性一般通过对生物样本中ADA检测以及体外细胞因子释放程度来评估。ADA检测已经充分引起各个监管机构的关注，NMPA、FDA、 EMA均推荐采用筛选、确证以及表征的层级形式进行评估。由于免疫原性的评估结果高度依赖于所选择的评估方法，故对于ADA的检测，主要为开发并验证分析方法，并采用验证的方法对临床或者临床前研究中对生物样本进行分析。TGN1412事件发生后，利用体外实验系统评估药物诱发细胞因子释放的潜在风险，已经成为危险识别和潜在风险评估的工具[18-19]，体外细胞因子释放实验 (cytokine release assays，CRA)也取得很大进展，目前已有多种CRA方法用于预测 CRS发生的风险。但是由于免疫系统的复杂性，各类CRS发生机制不同，建立标准化的体内动物模型和体外细胞因子释放试验模型并不可行，故针对细胞因子释放试验， EMA并未进行要求，FDA只是简单提及，而NMPA首次将体外细胞因子试验提到法规层面，对体外细胞因子试验的策略、基本观察指标做了相对具体的要求，这对于引领世界范围内的免疫原性评估提供了参考。本文将对NMPA、FDA、EMA发布的关于免疫原性的指导原则进行深度的比较和解读，包括：适用范围、评估策略、方法开发要求、方法学验证参数和接受标准等。
1. 适用范围
NMPA、FDA、EMA发布的免疫原性指导原则均对适用范围做了准确的描述，同时也给出了定位：基于行业和监管机构目前认知水平下制定的技术型指导原则，虽非强制要求，但是作为监管机构的发文，仍然具有非常大的约束力。
表2 各国免疫原性评估指导原则适用范围以及法律地位
2. 免疫原性评估的策略和流程
虽然NMPA、FDA、EMA都建议一种基于风险的策略去评估免疫原性，但均未提出风险分类方法。主要原因是单一的风险分类策略无法涵盖众多与产品、患者和疾病相关的风险。相反，监管机构鼓励药物开发人员对特定产品进行风险评估，强调对可能引发有害免疫反应的产品、患者和疾病相关因素进行全面分析，并相应地调整免疫原性管理计划。对于ADA的检测，NMPA、FDA、EMA均提倡分级评估的策略，首先对所有样品进行筛选试验，其次对阳性样品的特异性进行确证试验，对已确定的阳性样品进行滴度试验，以及通过功能性试验对抗体中和活性进行检测。其中在已确定的阳性样品中，还应考虑确定抗体同种型、亚型和结合表位的检测。NMPA、FDA、EMA对免疫原性多层级检测决策树基本一致，如下图所示：
图5 ADA检测的分级评估策略[17]
对于细胞因子释放试验，EMA并未要求，FDA也仅是简单提及，而NMPA首次将体外细胞因子试验提到法规层面，对体外细胞因子试验的策略、基本观察指标做了要求：基于细胞因子释放机制设计合适的体外细胞因子释放试验，如果药物直接靶向免疫细胞，可采用外周血单个核细胞进行试验，如果机制可能与FcγRs结合相关，则更适合在包含表达FcγRs细胞的全血中进行试验，观察指标包括但不限于IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α。
3. 方法开发要求
NMPA、FDA和EMA均建议根据药物研发所处的阶段以及药物潜在风险评估的结果选择合适的免疫原性评价方法，制定与预期计划相关的综合分析策略，对于ADA方法开发阶段，关注的重点如下表所述：表3 各国免疫原性评估的指导原则方法开发关注的重点比较对于体外细胞因子释放试验，NMPA于2021年发布的指导原则给出比较明确的指导，即：方法开发的重点在于根据药物作用的机制，选择合适的评价体系（人全血或人外周血单个核细胞）以及监测指标。如果产品的性质或同类别的历史数据已经预期具有有害免疫原性，则应在临床试验前完成方法的开发和验证。
4. 方法学验证参数的比较
对于ADA的检测，NMPA、FDA、EMA的指导原则均从免疫原性的检测流程上分为筛选、确证和表征3个阶段。3个指导原则对于方法学验证的参数基本相同，如表3所示，但NMPA和FDA的指导原则给出更加具体的要求和做法，而EMA相对宽泛。
注：+：需进行此项考察；-：未提及。
对于体外细胞因子释放试验，NMPA首次将其提到指导原则的高度，给出研究的策略，以及基本考察参数，但具体检测的技术细节并未给出，还需根据药物的特性制定具体的方法开发和验证计划。
4.2 方法学性能参数的验证方法和接受标准比较
对于ADA生物分析，NMPA、FDA、EMA指导原则中验证的内容和接受标准异同点详见下表。表6 ADA检测方法学性能参数的验证方法和接受标准比较
注：由于FDA/2019中引用了USP 1106.1[20]，故本表格中FDA/2019中有部分内容来自USP 1106.1。
对于细胞因子释放试验，FDA提出基本概念和要求，而NMPA提出了基本可行的试验策略和监测指标，但并未对验证的接受标准做详细规定。综上比较，笔者发现NMPA、FDA、EMA免疫原性指导原则有以下异同点：①EMA的指导原则缺乏详细的指导，其优势在于过程的灵活性，这一行为将减少在这一迅速发展和具有科学挑战性的领域中出现需求冲突的风险，但是会增加采用不完整的数据集进行评估的风险。②NMPA和FDA发布的指导原则要详细得多，特别是在ADA检测上，可以在产品开发过程中提供更详细更具规范性的指导，还可以更好地预测监管审查的结果。然而，它也可能阻碍药物的开发，并需要大量的资源去进行免疫原性的评估。③在ADA的检测策略上，NMPA、FDA、EMA高度一致，均采取分级评估的方式，即筛选试验，验证试验，中和试验和滴度实验，故在ADA检测过程中应避免改变策略，但如果必须进行检测策略的修改，则必须提前与监管部门沟通并确保这些改变不会影响对产品的免疫原性评估。④针对细胞因子释放试验，EMA并未单独进行要求，FDA仅提出基本概念，只有NMPA首次将体外细胞因子试验提到法规层面，对体外细胞因子试验的策略、基本观察指标做了相对详细的要求，这对于引领世界范围内的免疫原性评估策略提供了参考，也走在了世界前沿。⑤EMA和FDA制定的免疫原性研究指导原则虽基于不同的立法和监管理念，但主要的指导方针在科学层面上是一致的，对于生物分析方法开发和验证的指导上，FDA比EMA更具指导意义，我国NMPA最新发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》吸收两家之长并且结合中国国情，对中国境内的免疫原性评估更具指导意义。⑥虽然NMPA、FDA、EMA都建议一种基于风险的策略去评估免疫原性，然而简单的风险分类策略无法涵盖众多与产品、患者和疾病相关的风险。监管机构也鼓励药物开发人员对特定产品进行风险评估，强调对可能引发免疫原性的产品、患者和疾病相关因素进行全面分析，并制定相应的免疫原性管理计划。ADA检测高度依赖所选择的方法，所以不同实验室对得到的ADA发生率应谨慎比较。另外由于不同病人或个体之间产生的抗药抗体类型以及含量可能具有较大的差异，故ADA和NAb对安全性、PK、药效学、总体疗效的潜在影响可能存在患者差异。为了降低免疫原性为研发进程带来的阻碍，采用必要的数学模型，结合蛋白质组学和基因组学技术，预测个体或某一群体的免疫原性结果变得可行，这样可以降低药物由于免疫原性管理带来的研发成本。随着基因疗法的普及，也将对免疫原性评估带来了新的挑战，因涉及大量有活性的免疫细胞回输，CRS是必须要重视的不良反应，利用CRA评估药物诱发细胞因子释放的潜在风险已经成为危险识别和潜在风险评估的重要工具。但是由于人体免疫系统的复杂性，各类CRS发生机制不同，目前还没有特定的体外CRA可以适用于所有CRS预测，开发出适用范围广、结果精准的CRA预测平台是未来所需。随着科技的进步，新的治疗性蛋白药物和治疗方式必将成为医药产业的焦点，而免疫原性仍然是生物疗法发展中要面对的一个重要问题。作为一种跨学科的方法，免疫原性评估需要生物分析、生物化学、免疫学、肿瘤学、药理学等多学科的密切配合。科学合理的免疫原性分析和评估可加速药物筛选、体外和体内试验的进程，并可能成为重要的评估工具。目前，世界范围内多数地区或组织并无免疫原性综合评价的指导原则，对免疫原性评价的要求、标准、解释比较混乱，评价的主要标准目前还依赖FDA、EMA等机构的指导原则。2021年3月29日国家药品监督管理局正式发布实施《药物免疫原性研究技术指导原则》，填补了我国免疫原性研究相关技术规范的空白。随着国内药物研发技术的发展以及药物研发人员水平的提高，中国必将在免疫原性评估领域方面作出更多贡献。[1] João A. Pedras-Vasconcelos, PhD The immunogenicity of therapeutic proteins-what you don’t know can hurt you and the patient. SBIA REdI Fall 2014.[2]《药物免疫原性研究技术指导原则(征求意见稿)》起草说明 NMPA, 2020.[3] PraditpornsilpaK, Tiranathanagul K, Kupatawintu P et al. Biosimilar recombinant humanerythropoietin induces the production of neutralizing antibodies[J]. Kidney Int.80(1), 88–92 (2011).[4] ShinSK, Moon SJ, Ha SK et al. Immunogenicity of recombinant human erythropoietin inKorea: a two-year cross-sectional study[J]. Biologicals. 40(4), 254–261 (2012).[5] 2019 ASCPT Annual Meeting artwork designed by GRAPHEK Design Studio. ADA.[6] ChatenoudL, Ferran C, Legendre C. In vivo cell activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and modulation by corticosteroids[J]. Transplantation,1990, 49(4): 697-702.[7] LeeD W, Gardner R , Porter D L , et al. Current concepts in the diagnosis andmanagement of cytokine release syndrome[J]. Blood ,2014, 124 (2 ) :188 - 95 .[8] Tisoncik J R, Korth M J , Simmons C P, et al. Into the eye of the cytokinestorm[J] . Microbiol Mol Biol R ee, 2012, 76 (1): 16 - 32.[9] Peter J B, Ram A, Renold J C, et al. Momoclonal antibody-induced cytokine-releasesyndrome [J]. Expert Rev Clin Im m unol, 2009, 5(5) :499 - 521 .[10] Suntharalingam G, Perry M R, Ward S, et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of theanti-CD28 monoclonal antibody TGN1412[J] .N Engl J Med. 2006 Sep 7; 355(10):1018-28.[11] Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing andValidating Assays for Anti-Drug Antibody Detection Guidance forIndustry,January 2019.[12] Guidelineon Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006).[13] Guidelineon Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Rev 1), 1st Dec 2017.[14] PekkaKurki, Compatibility of immunogenicity guidance by the EMA and the US FDA, 2019.[15] Guidance for Industry Immunogenicity Assessment for Therapeutic ProteinProducts August 2014.[16]《药物免疫原性研究技术指导原则》(征求意见稿), NMPA, 2020.08.[17]《药物免疫原性研究技术指导原则》,NMPA, 2021.03.[18] Fincc D ,Grimaldi C ,Fort M ,et al. Cytokine release assays : current practicesand future directions [ J ] . Cytokine,2014, 66(2) : 143 - 55 .[19] Vidal J M,Kawabata TT,Thorj De R ,et al. In vitro cytokine release assays forpredicting cytokine release syndrome : the current state-of-the-science. Reportof a European Medicines Agency Workshop [ J ] . Cyokie,2010, 51(2) :213 - 5.[20] USP ,1106.1,Immunogenicityassays—design and validation of Assays to detect anti-drug neutralizing antibody , May 1, 2016.
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