质粒构建的原理及步骤

质粒构建的原理

外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。

质粒构建流程示意图

质粒构建的步骤

目标片段的过程主要有三个步骤：▼▼▼

01

PCR 扩增

「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。

PCR 扩增

简要步骤：

利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。